超声波处理对根癌农杆菌介导转化金钗石斛影响的初步研究

以金钗石斛的类原球茎体（PLB6）为受体材料,研究了侵染前材料不同创伤处理对农杆菌介导转化频率的影响。结果表明：25KHz超声波40～80W处理5～10min或100W处理5min对PLBs死亡率无不良影响;1／2MS液体培养基适宜作为超声溶液;80～100W超声波处理5min的PLBs在转化后GUS染色每100mg鲜重材料上的蓝色斑点数由常规方法处理的0～0．54提高到6．05～7．90,GUS基因瞬时表达频率得到提高;筛选两个月后多数PLBs的GUS基因仍能稳定表达。说明超声波处理能提高农杆菌介导转化金钗石斛PLBs的频率。     

不同附生树种对金钗石斛石斛碱含量的影响

[目的]测定不同附生树种金钗石斛中石斛碱的含量。[方法]以贵州赤水仿野生3年苗为试验材料,不同树种继续附生生长1年,采用气相色谱内标法,测定不同附生树种金钗石斛中石斛碱的含量。色谱柱:DB-1(30 m×0.25 mm×0.25μm);程序升温:初始温度80℃,10℃/min升温至250℃,保持5 min;进样口温度250℃;FID检测器温度250℃。[结果]不同附生树种金钗石斛中石斛碱的含量有明显差异,其中,杉木附生金钗石斛的石斛碱含量最高,为0.932%,枇杷、杨梅、龙眼附生金钗石斛石斛碱含量分别为0.825%、0.790%和0.601%。[结论]不同附生树种的金钗石斛石斛碱含量均符合2015版《中国药典》限量要求,该研究为确定适宜的附生树种提供参考依据。     

光照强度对金钗石斛吸收氮素的影响

应用15N 研究光强度对金钗石斛吸收氮素的影响,结果表明光强度为 2×104Lx 处理,在石斛生长的四个阶段吸收营养液中氮量分别比光强度为 5×10Lx 处理高 26．54％,50．07％,31．11％和 22．22％;吸收木屑培养基质中的氮量分别提高 32．84％,43．41％,21．85％和 19．01％;吸收总氮量分别提高 29．19％,46．44％,26．01％和 20．51％。在石斛生长的四个阶段,光照强度为 2×104Lx 处理,植株干物重分别比 5×103Lx 处理提高 12．40％,22．22％,17．08％和 15．00％;但是,光照强度为 5×103Lx 处理根干物重较光强为 2×104Lx 处理高 18．21％,9．63％,10．04％和18．45％。     

农杆菌子房注射法对金钗石斛的活体转化研究

对金钗石斛 Dendrobium nobile 进行人工自花授粉,在授粉之后10、20、30、40、45、50和60 d分别将工程化根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens EHA105(pCAMBIA1301)直接注射入子房内部.150 d后,金钗石斛蒴果成熟,摘取果实,进行种子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色、无菌播种、潮霉素筛选以及PCR检测试验.结果表明：子房注射对果实发育具有较大影响,在授粉后10~30 d进行子房注射后,果实脱落;在授粉后45 d进行子房注射,成熟果实注射部位的种子GUS染色率最高,可达18%;无菌播种之后,经潮霉素筛选,获得11株幼苗,每株植株均表现出GUS染色反应;随机挑选4株幼苗进行PCR检测,发现均能扩增出预期条带,说明外源基因已经整合到植株基因组内.农杆菌子房注射法在兰科植物转基因的成功应用,可以为兰科植物育种提供一种简单高效的方法.     

益生元低聚糖对发酵乳杆菌CH4的促生长作用

内蒙古奶豆腐中分离的一株优良益生特性的乳杆菌菌株CH4经API 50 CHL和16S r DNA序列分析鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。本研究分析了益生元对CH4生长的促进作用。单因子试验表明,棉籽糖对CH4的促生长能力最强,添加量为1.5%,培养时间为10 h有利于菌株CH4的生长。利用正交试验进行验证,最终确定发酵乳杆菌CH4的生长条件为:培养基中添加1.5%棉籽糖,培养11 h,发酵乳杆菌CH4的活菌数达到8.65×1010CFU/m L,与未添加低聚糖培养时相比提高40倍。     

干旱胁迫对金钗石斛幼苗生理生化的影响

用加有不同浓度聚乙二醇(PEG6000)(0,5%,10%,15%,20%,25%)的MS培养液模拟干旱胁迫,胁迫时间分别为3 d9、d和15 d,并测定干旱胁迫对金钗石斛幼苗生理生化特性的影响。结果表明:干旱胁迫可以引起金钗石斛幼苗脯氨酸、可溶性糖的积累,降低可溶性蛋白质相对含量,增大细胞质膜的相对透性;随着胁迫强度和时间的增加,各生理生化特性变化明显。     

利用正交设计优化金钗石斛的转化体系

为优化金钗石斛的转化体系,以其类原球茎(PLBs)为材料,利用正交设计研究了影响农杆菌介导转化的因素.结果表明:PLBs预培养1 d、侵染的菌液OD600值1.2、乙酰丁香酮(AS)100μmol/L、共培养5 d时,每100mg鲜物质量材料上的GUS染色蓝点数最多;单因子试验表明AS适宜的浓度为50μmol/L;PCR结果显示得到了转化呈阳性的PLBs;初步表明此体系可用于金钗石斛的遗传转化研究.

Abstract：

In order to optimize the Agrobacterium-mediated transformation system for Dendrobium nobile Lindl, effects of preculture time, bacterial concentration, acetosyringon (AS) concentration and co-cultivation time on Agrobacterium-mediated transformation of protocorm like bodies (PLBs) of D. nobile Lindl were studied in an experiment with orthogonal design. The results showed that number of GUS staining blue spots per 100 mg flesh weight of PLBs was the greatest in the treatment of the combination of preculture for one day, 1.2 of bacterial concentration (OD600), 100 μmol/L of concentration of AS and co-culture for five days. Single factor experiment showed that the appropriate concentration of AS was 50 μmol/LPCR confirmed that positive transformed PLBs were obtained. It is tentatively concluded that this system can be used in the study of transformation of D. nobile Lindl.     

种质与环境对金钗石斛药材品质的影响

将7个不同种质的金钗石斛苗分别在3个栽培基地进行多点栽培试验，测定多点栽培金钗石斛的外观性状、产量及活性成分含量，并结合各栽培基地的气象资料，采用数理统计软件分析种质与环境对金钗石斛药材品质的影响。结果表明，在同一栽培基地中，不同种质金钗石斛外观性状、产量、活性成分含量均存在差异，根据联合方差分析可知金钗石斛茎长、茎直径、产量及石斛碱含量主要受种质因素影响，叶长、叶宽、多糖含量主要受种质与环境因素交互作用影响。影响金钗石斛的主要气候因子是相对湿度、1月均温、平均最低气温、年平均温度；直径短边与年平均温度呈显著负相关，生长在年平均温度较低的地区金钗石斛直径短边较粗壮；叶长与1月均温呈显著负相关，1月均温较低的地区适宜金钗石斛叶片长度的生长；叶宽与年平均温度呈显著正相关，年平均温度较高的地区适宜金钗石斛叶片宽度的生长；多糖含量与年平均温度呈显著负相关，年平均温度较低的地区适宜金钗石斛多糖含量的积累。     

不同叶面肥对金钗石斛幼苗生长和药用成分含量的影响

为明确不同叶面肥对金钗石斛幼苗生长和药用成分的影响,在金钗石斛幼苗栽培基质上设置不同小区,喷施不同种类的叶面肥后,测定金钗石斛幼苗形态指标、多糖和石斛碱的含量.结果表明：不同叶面肥对石斛幼苗生长效果不同,喷施沼液肥效果最好,与不施肥相比,茎粗增加33％、根长增加67％、株高增加29％、分蘖数增加75％、叶片数增加79％、茎节数增加54％、产量增加67％,根多糖含量增加93％、茎多糖含量增加110％、叶多糖含量增加68％、茎部石斛碱含量增加156％.无机性叶面肥1、叶面肥2和多元素复合肥的施用效果差于沼液肥.所以喷施沼液肥能够显著促进金钗石斛幼苗的生长和药用成分含量的提高.     

金钗石斛复方对小鼠免疫功能的影响

为了研究金钗石斛复方对小鼠免疫功能的影响,将实验小鼠随机分为对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组;采用Con A诱导小鼠淋巴细胞转化试验及迟发性变态反应试验测试试验组小鼠的细胞免疫功能;采用抗体生成细胞检测及溶血试验测试其体液免疫功能;采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验测试其特异性免疫功能.结果表明,与对照组比较,金钗石斛复方能够明显提高脾淋巴细胞增殖能力、溶血空斑数、小鼠抗体积数、巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力;金钗石斛复方对提高小鼠NK细胞活性能力无显著影响.金钗石斛复方对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫及巨噬细胞功能均有明显的增强作用.     

霍山石斛生物碱的提取及铁皮石斛的鉴别

采用超声波辅助酶法提取霍山石斛中的生物碱，通过对固液比、超声时间、超声功率、酶解时间、复合酶（纤维素酶和果胶酶1∶1等活力混合）质量分数的单因素试验和正交试验，确定提取最佳的条件；通过气相色谱-质谱法对霍山石斛中生物碱的组成成分进行分析；通过傅里叶变换红外光谱及二阶导数变换谱图快速鉴定霍山石斛和铁皮石斛。结果表明，当固液比为1:40（g·mL^-1），超声时间为20 min，超声波功率为200 W，复合酶（纤维素酶和果胶酶1∶1等活力混合）添加量1.5%，酶解时间1.5 h为提取条件时，提取效率最佳，生物碱得率为0.053%。根据气相色谱-质谱法检测结果可得知，相对于铁皮石斛，霍山石斛的石斛碱和6-羟基石斛次碱为其特殊生物碱。二阶导数变换谱图可更直观地通过二者峰形状、个数和强度的不同来区分。因此，可以将气相色谱质谱联用和傅里叶红外光谱结合在一起来高效鉴定霍山石斛与铁皮石斛。     

铁皮石斛RRT家族全基因组鉴定及表达分析

多糖是药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale)的主要成分之一。鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖转移酶(rhamnogalacturonⅠrhamnosyltransferase, RRT)在Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖的合成中起重要作用。利用生物信息学在全基因组水平鉴定出4个铁皮石斛RRT家族基因( DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT3、 DoRRT4),通过逆转录定量PCR检测该基因家族在不同组织和胁迫下的表达情况。结果表明：在系统发育上DoRRT1、DoRRT3被聚为一组,DoRRT2、DoRRT4被聚为一组;DoRRT蛋白均为亲水蛋白质,可定位于高尔基体;DoRRT蛋白的α-螺旋和无规卷曲较多;4个DoRRT蛋白均有O-FucT保守结构域;组织表达显示 DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT4在根、茎、叶中均有表达,且在地上部的转录水平较高;胁迫表达表明 DoRRT2、 DoRRT4在高温胁迫下表达显著下调, DoRRT2在PEG模拟干旱条件下表达显著下调,说明 DoRRT2、 DoRRT4参与非生物胁迫响应。以上结果为深入研究DoRRT的生物学功能提供数据...     

铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

SEP3(SEPALLATA3)基因是MADS-box家族中的一员,在花器官的形成和发育过程中具有重要作用.为了解SEP3基因在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的成花转变机理,从铁皮石斛转录组序列中获得一个SEP3基因序列,并命名为DoSEP3.预测其编码区长度为354 bp,预测编码117个氨基酸.DoSEP3蛋白相对分子质量13457.87 Da.其不稳定系数为60.53,亲水性的平均值为-0.121,是不稳定的亲水性蛋白,主要在内质网和细胞核中起作用.二级结构主要以α-螺旋为蛋白质最大量的结构元件,跨膜区分析推测DoSEP3蛋白质具有一个跨膜区.进一步的氨基酸比对显示,铁皮石斛DoSEP3蛋白与金钗石斛SEP3蛋白亲缘关系最近,可能具有类似的功能.基于生物信息学分析,利用CRISPR/cas9技术构建铁皮石斛基因敲除载体,并使用农杆菌介导法进行遗传转化,且已获得阳性原球茎,可为后续的SEP3基因表达研究奠定基础.     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

鳙鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及其毒力基因检测

从患病鳙鱼中分离纯化得到一株优势菌株AH-YS,通过革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定以及16S r RNA基因扩增、测序和系统进化分析等操作,结果显示,分离到的细菌为维氏气单胞菌。药敏试验显示,在使用的11种抗菌药物中,该菌株对氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星等9种药物敏感,对甲氧苄氨嘧啶和氨苄西林耐药。对9种毒力基因的扩增结果显示,可以检测到气溶素、细胞毒性肠毒素、鞭毛、弹性蛋白酶和酯酶5种。     

克氏原螯虾布氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏分析

从患病的克氏原鳌虾(Procambarus clarkii)中分离纯化得到一株优势菌株AX1707。通过革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定、16S rRNA基因测序和进化树构建等操作进行分析,结果显示,AX1707为布氏柠檬酸杆菌(Citrobter braakii),人工感染试验结果显示该菌具有较强致病性,药敏试验结果显示其对恩诺沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、复方新诺明、庆大霉素和多西环素敏感,对四环素和新霉素中度敏感,对红霉素和氨苄西林耐药。     

栽培模式对霍山石斛生长和主要内含物的影响

通过测定大棚栽培、林隙地栽培和活树附生等3种栽培模式下,霍山石斛的生长量、石斛多糖、石斛碱、氨基酸和含水率等含量,对比其生长和内含物的差异性来明确适宜的栽培模式。结果表明：活树附生栽培的霍山石斛多糖、石斛碱和氨基酸含量最高,大棚栽培模式最低（P < 0.05）,活树附生栽培下的霍山石斛单糖和钾元素含量高于林隙地栽培和大棚栽培（P < 0.05）,不同栽培模式下霍山石斛内含物含量之间均为正相关;林隙地栽培和大棚栽培的霍山石斛茎长显著高于活树附生栽培（P < 0.05）,但3种栽培模式的萌蘖数、茎粗与茎节差异不显著;大棚栽培的霍山石斛含水量达92.13%,显著高于林隙地栽培的90.37%和活树附生的85.72%,鲜重差异表现与含水量相同,但干重差异不显著。综上,活树附生栽培下霍山石斛活性成分积累较多,品质更好,是一种适宜大别山区推广的种植方式。     

苹果绵蚜耐饥饿能力研究

【目的】明确苹果绵蚜在饥饿状态下的存活能力和温、湿度对苹果绵蚜耐饥饿能力的影响。【方法】在实验室控制条件下,研究苹果绵蚜不同虫态及其在供食叶片、供食枝条(只供食叶片和枝条,但不保湿、不更换)、完全饥饿(空白对照,不提供食物)3种处理下的耐饥饿能力,以及完全饥饿条件下不同温度(15~31℃)、湿度(40%~80%)对苹果绵蚜耐饥饿能力的影响。【结果】苹果绵蚜低龄若蚜存在逃逸现象,表现出较强的活动能力。苹果绵蚜的耐饥饿能力由强到弱依次为4龄若蚜>雌成蚜>3龄若蚜>2龄若蚜>1龄若蚜;不同处理的耐饥饿能力表现为供食枝条>供食叶片>空白对照。在饥饿条件下,苹果绵蚜的存活率随饥饿时间的延长而降低,且均呈初期缓慢、中间较快、后期缓慢的下降趋势。在温度为15~31℃时,温度越高,苹果绵蚜的耐饥饿能力越弱;在湿度为40%~80%时,湿度越低,其耐饥饿能力也越弱。【结论】苹果绵蚜特别是4龄若蚜具有较强的耐饥饿能力,对恶劣环境具有较强的耐受性,即使在恶劣的环境条件下也具有传播扩散的潜在危险,环境对苹果绵蚜的耐饥饿能力影响较大。     

野生与人工栽培铁皮石斛内生真菌生物多样性比较及抗炭疽病活性菌株的筛选

【目的】系统分析和比较野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale内生真菌的多样性,并从中筛选抗炭疽病活性的菌株。【方法】利用组织块分离法分离铁皮石斛内生真菌,采用载玻片培养法和基于rRNA内转录间隔区基因(rDNA-ITS)的分子鉴定法对它们进行鉴定,采用平板对峙法筛选抗炭疽病内生真菌。【结果】从铁皮石斛中分离到236株内生真菌,其中132株分离自野生植株,104株分离自人工栽培植株,野生植株内生真菌的总定殖率(50.46%)、总分离率(61.11%)及多样性指数(2.95)均明显高于人工栽培植株(其相应数值分别为39.35%、48.14%和2.49);筛选到34株对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides具抑制活性的内生真菌菌株,其中菌株F102(蜡孔菌Ceriporia sp.)、F27(硬孔菌Rigidoporus sp.)、F103(蚁巢伞菌Termitomyces sp.)和F122(伏革菌Peniophora sp.)的抑制效果较好,抑菌率分别为93.06%、88.20%、87.48%和84.57%。【结论】野生与人工栽培铁皮石斛内生真菌的生物多样性和类群结构具有明显差异,并且其中蕴含着丰富的抗炭疽病活性菌株,这为人工栽培铁皮石斛药材品质的改良及其炭疽病的生物防治奠定了基础。     

一株克氏原螯虾病原——霍乱弧菌的分离鉴定

从尾扇边缘溃烂的克氏原螯虾中分离到一株优势菌LK-18,并对该菌株进行种属鉴定和致病性分析。通过菌落形态观察、16S rRNA测序、血清型分析及基因特性鉴定对细菌的类别进行初步判断,并采用浸泡感染、肌肉注射和腹腔注射等方式进行人工感染实验对细菌的致病性进行评估。经16S rRNA测序分析和4个管家基因（atpA、pyrH、recA、gyrB）串联分析,该菌株最终被鉴定并命名为Vibrio cholerae LK-18。V. cholerae LK-18经PCR鉴定不属于O1和O139血清型,但含hly毒力基因和几丁质分解相关的几丁质酶（chitinase,Chi）基因。人工感染实验虽未能重现烂尾症状,但从克氏原螯虾烂尾组织中分离的V. cholerae LK-18具有致病性,能够引起克氏原螯虾的死亡。研究结果表明霍乱弧菌LK-18是一种致病菌,不仅扩大了非O1/O139群霍乱弧菌的感染宿主范围,同时预警霍乱弧菌有导致克氏原螯虾养殖业暴发疾病的可能,因此要提前做好该疾病的预防工作,从而避免霍乱弧菌感染带来的损失。