国内首例绿色荧光蛋白"转基因"克隆猪问世

曾培育出我国首例成体体细胞。克隆”东北民猪的东北农业大学教授刘忠华带领的课题组，2006年12月22日又成功培育出国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪，这是世界上继美国、韩国．日本之后第4例绿色荧光蛋白转基因猪。     

绿色荧光蛋白“转基因”猪问世

曾培育出我国首例成体体细胞“克隆”东北民猪的东北农业大学教授刘忠华带领的课题组，于2006年12月22日又成功培育出国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪，这是世界上继美国、韩国、日本之后第四例绿色荧光蛋白转基因猪。     

繁殖候选基因Lhx8的真核表达和定位分析

从猪卵巢组织中提取总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了猪Lhx8基因的完整开放阅读框,将该基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经酶切分析和测序证明成功构建了真核重组质粒pEGFP-N1-Lhx8。将成功构建的pEGFP-N1-Lhx8分别转染猪肾细胞PK-15和猪颗粒细胞(GCs),转染后48 h,通过荧光显微镜观察对猪Lhx8基因在这2种细胞中的定位特点进行分析。结果显示:绿色荧光呈点状分布,根据绿色荧光分布的位置,推测Lhx8蛋白很可能位于细胞核中。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

猪TOLL样受体2基因在CHO-K1细胞中的表达

将含猪TLR2(猪Toll样受体2,pTLR2)基因的真核表达载体PcDNA3.1/CT-GFP-pTLR2,采用脂质体法转染到CHO-K1细胞,用G418持续筛选获得了阳性细胞克隆.阳性细胞克隆系经PCR和RT-PCR检测表明:pTLR2基因得到稳定整合并能成功地转录.荧光显微镜观察,转染细胞可见绿色荧光,表明获得了表达pTLR2的克隆细胞系.     

黑龙江省科技进步一等奖 东北民猪体细胞核移植及绿色荧光蛋白转基因猪研究

<正>主要研究内容包括:1、猪卵母细胞体外成熟培养体系;2、东北民猪、大白猪和哈白猪体细胞采集培养和冷冻保存;3、绿色荧光蛋白基因转染体细胞及筛选:4、体细胞核移植胚胎的构建和体外发育;5、绿色荧光蛋白转基因阳性细胞核移植、体外胚胎发育以及外源基因表达检测;6、受体猪选择、移植前处理、胚胎移植及妊娠受体猪管理。     

猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素（Myostatin,MSTN）基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9 kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞（PK15细胞）,用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14 kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。     

绿色荧光蛋白在植物上应用研究进展

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于海洋生物多管水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的一种功能独特的生物发光蛋白。能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。随着进一步对绿色荧光蛋白结构及其发光特性的研究,以及对绿色荧光蛋白基因的成功克隆,对多种新型绿色荧光蛋白的成功改造,使对多种目标进行实时监测成为可能。文中综述了绿色荧光蛋白的发展过程、改进及应用的研究进展。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。     

猪CTSZ基因的克隆及真核表达载体的构建

组织蛋白酶Z基因(Cathepsin Z gene, CTSZ)是影响猪生长、肉质等性状的一个重要候选基因.本研究以长白猪的背最长肌为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆CTSZ基因CDS序列全长,对该序列进行了生物信息学分析,并构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,通过脂质体介导瞬时转染猪成纤维细胞,30 h后进行荧光表达检测.结果本试验克隆出猪CTSZ基因CDS全序列912 bp,并成功构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,瞬时转染后在猪成纤维细胞中表现为绿色荧光蛋白表达.本试验为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础.     

猪PDCD5基因的克隆与真核表达

用RT-PCR方法从猪肝组织中扩增出猪PDCD5(programmed cell death 5)编码序列,TA克隆至pMD-19T载体中,软件分析猪PDCD5基因的核算序列和蛋白序列,进行染色体定位.构建真核表达载体,将PDCD5基因编码区序列插入绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中.通过脂质体转染法将重组载体瞬转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs)进行瞬时表达.结果表明:该序列编码125个氨基酸,猪PDCD5基因定位于猪6号染色体,含有6个外显子,与人PDCD5基因高度同源.双酶切鉴定和测序表明:重组真核表达载体构建成功,荧光检测和Western blot检测显示PDCD5融合蛋白表达.研究结果为探讨猪PDCD5基因在细胞凋亡调控中的功能提供了基础数据.     

版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。     

绿色荧光蛋白基因标记枯草芽孢杆菌研究

将源于枯草芽孢杆菌168的木糖启动子xylR和来源于载体pGFPuv的gfp基因连接,插入枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pIM,成功构建了以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组载体pIM-GFP.转化枯草芽孢杆菌菌株BS523,突变株在荧光显微镜及紫外灯下均观察到较强的绿色荧光,同时PCR鉴定结果正确.表明重组载体pIM-GFP成功转入菌株BS523,并且gfp基因成功表达.     

猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定

[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪CDK9基因的克隆及其过表达对SUVEC细胞周期的影响

【目的】克隆猪细胞周期蛋白激酶9(CDK9)基因,观察该基因过表达对猪脐静脉血管内皮细胞(SU-VEC)周期的影响。【方法】采用电子克隆方法筛选得到猪CDK9基因全长序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出包含完整开放读码框架(ORF)的CDK9 cDNA片段,将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组真核表达载体pEGFP-CDK9。将pEGFP-CDK9以脂质体介导法转染至SUVEC细胞,采用绿色荧光标记和Western blot检测SUVEC细胞中CDK9基因的表达,用流式细胞仪检测转染CDK9基因后SUVEC细胞周期的变化。【结果】得到猪CDK9基因全长1820bp的cDNA序列,其ORF为1119bp,编码372个氨基酸;CDK9分子质量为42.76ku,等电点为9.04;CDK9基因定位于猪的1号染色体上。酶切和测序结果证明,重组真核表达载体pEGFP-CDK9构建成功。pEGFP-CDK9转染SUVEC细胞48h后,荧光显微镜和Western blot检测到目的基因序列在SUVEC细胞中成功表达;试验组各期SUVEC细胞比例与空载体组相比,差异无统计学意义(P0.05),细胞周期未发生显著变化。【结论】克隆了猪CDK9基因,并在SUVEC细胞中成功进行了表达。CDK9基因的过表达未引起细胞周期发生显著变化,其可能并不参与细胞周期的调控。     

猪CFL2b/荧光蛋白融合基因在小鼠成肌细胞中的表达与定位

[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

应用重组PCR构建猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白融合基因

膜联蛋白A2是膜联蛋白多基因家族成员之一,在Ca2+存在时能与带负电荷的磷脂结合。最近研究显示,膜联蛋白A2在病毒感染方面发挥了重要作用。本研究应用RT-PCR和PCR方法分别获得了猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)。然后用重组PCR技术成功构建了膜联蛋白A2-EGFP融合基因,为研究膜联蛋白A2在病毒感染细胞中的定位和表达,以及病毒和宿主细胞相互作用奠定了基础。     

携带绿色荧光蛋白的重组昆虫杆状病毒的构建

将GFP cDNA片段克隆到昆虫杆状病毒的转移质粒pBacPAK8上,构建成携带绿色荧光蛋白的表达载体pBacPAK8-GFP;采用脂质体共转染法,将载体pBacPAK8-GFP DNA和亲本病毒Ac-BacPAK6 DNA共转染Sf21细胞,荧光均匀地分布于整个细胞.病毒经空斑分离法,成功分离病毒克隆,获得了重组绿色荧光蛋白的杆状病毒.     

猪Gasp1和Gasp2基因对C2C12细胞分化的影响

为研究猪Gasp1、Gasp2对成肌细胞分化的影响,采用RT-PCR技术从猪肌肉组织中扩增Gasp1和Gasp2基因片段,将其克隆入phi C31载体,构建重组质粒phi C31-Gasp1和phi C31-Gasp2。将重组质粒转染至C2C12小鼠成肌细胞,经嘌呤霉素筛选在荧光显微镜下观察,获得稳定表达Gasp1和Gasp2基因的细胞系后,应用CCK-8法检测细胞增殖能力。分别在细胞分化1、2、3、4、5 d时收集细胞,采用实时荧光定量PCR检测MyoD、MyoG、P21及MHC肌细胞分化相关基因的表达变化,进而分析Gasp1和Gasp2基因对肌肉分化的影响。结果显示,成功克隆了猪Gasp1和Gasp2基因,构建了phi C31-Gasp1和phi C31-Gasp2重组质粒,荧光显微镜下可见phi C31载体和Gasp1、Gasp2基因共转染的C2C12细胞表达强烈的绿色荧光,经CCK-8检测发现,过表达Gasp1、Gasp2基因对细胞的生长增殖影响为初期促进、后期抑制;实时荧光定量PCR检测结果表明,猪Gasp1和Gasp2可以促进细胞分化因子MyoD、MyoG、P21、MHC基因的表达。以上结果表明,Gasp1、Gasp2基因可以促进肌肉分化。