Cry1Ba3蛋白对亚洲玉米螟杀虫活性测定及其与BBMVs的结合分析

提取并纯化Cry1Ba3蛋白截短片段,用饲喂人工饲料的方法对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）初孵幼虫进行生物活性测定。结果显示,Cry1Ba3截短片段对亚洲玉米螟有良好的杀虫活性（LC50=5.29 μg/g,95%置信限为3.96～7.10 μg/g）。而纯化的Cry1Ac蛋白60 ku的活性片段对亚洲玉米螟初孵幼虫的杀虫活性LC50为0.83 μg/g。提取亚洲玉米螟5龄幼虫的BBMVs,用纯化的Cry1Ba3和Cry1Ac蛋白进行竞争结合试验,结果显示Cry1Ba3与Cry1Ac在亚洲玉米螟中肠的结合没有竞争作用,说明两种毒素在亚洲玉米螟BBMVs上可能存在不同的受体。     

亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白的交互抗性分析

Cry9Ee是近年来发现的对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)等害虫具有高毒力的蛋白,具有良好的应用前景。为了明确亚洲玉米螟对Cry9Ee和Cry1Ab蛋白是否存在交互抗性,本文首先分别表达、活化、纯化了Cry9Ee和Cry1Ab蛋白,进而对敏感和Cry1Ab抗性亚洲玉米螟进行生物活性测定;随后对2种蛋白在敏感亚洲玉米螟中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,简称BBMVs)上的结合进行分析比较。生物活性测定结果表明,Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的活性片段对敏感亚洲玉米螟的LC₅₀分别为3.04和0.89 μg/g;而Cry9Ee活性片段在5.00 μg/g的浓度下,对Cry1Ab蛋白抗性亚洲玉米螟致死率高达96%,与对敏感种群活性相当。竞争结合试验表明,Cry9Ee和Cry1Ab两种蛋白间不存在竞争结合,推测它们在亚洲玉米螟中肠上存在不同的受体。综合生物活性测定及体外结合试验两方面结果得出结论：亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白不存在交互抗性。cry9Ee基因可以作为理想的候选基因,用于我国新一代转基因抗虫玉米的研制,为延缓和克服亚洲玉米螟对转基因抗虫玉米抗性的产生提供重要保证。     

四种Bt蛋白对六种重要鳞翅目害虫的杀虫活性评价

筛选对靶标害虫高效、低毒的Bt蛋白对未来开发新型Bt生物杀虫剂、转基因抗虫植物新品种等具有重要意义。我们在室内测定了Cry2Ab4、Cry2Ah1、Cry1Ca7及Vip3Aa11四种Bt蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、黏虫、玉米螟、二化螟的杀虫效果。结果表明,Cry2Ab4杀虫谱广、对六种鳞翅目的重要害虫都具有很高的杀虫效果,尤其是对棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾和玉米螟的毒力效果显著;Cry2Ah1对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾具有很好的致死作用,对棉铃虫、玉米螟和二化螟也具有较好的杀虫效果,但对黏虫只有明显的体重抑制作用、致死效果不明显;Cry1Ca7对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾有明显的防治效果,其次对棉铃虫、二化螟也有较好的杀虫作用,但对玉米螟毒力效果较差,对黏虫没有毒力作用;Vip3Aa11对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的防治效果好,对玉米螟、棉铃虫和二化螟有较好的防治效果,但对黏虫没有毒力作用。     

对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。     

类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的影响

将克隆的黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达纯化,并分析其对Cry3A毒素杀虫活性的影响,从而探讨黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的增效作用。黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达产物为包涵体,经尿素变性后,用亲和纯化法可得到较纯的重组蛋白;随着类钙粘蛋白片段与Cry3A质量比值的升高,Cry3A毒素对黄粉虫的杀虫活性也逐步提高,当其比值为1时,活性达到最大,提高了2.5倍,而黄粉虫类钙粘蛋白片段对Cry3Am的杀虫活性却没有显著性影响。研究表明,黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素的杀虫活性具有增效作用。     

Cry1Ac抗性亚洲玉米螟对四种Bt蛋白的交互抗性

种Bt蛋白Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ah和Cry1Ie对敏感品系ACB-BtS和抗性品系ACB-AcR的毒力,结果显示,ACB-AcR对Cry1Ah的相对抗性倍数达14.9倍,有显著的交互抗性;对Cry1Ab的相对抗性倍数为4.3倍,交互抗性水平较低;对Cry1Ie的相对抗性倍数为0.9,即无交互抗性.4种蛋白对抗、感品系的EC50表明,ACB-AcR品系对Cry1Ac蛋白产生了显著的抗性,相对抗性达到32.6倍,对Cry1Ah和Cry1Ab有低水平的交互抗性,而对Cry1Ie没有交互抗性.     

苏云金芽胞杆菌Cry1Ba3 蛋白定点突变对杀小菜蛾活性的影响

Cry1Ba3是由本实验室发掘的对小菜蛾有高毒力的杀虫晶体蛋白。为了寻找对杀虫活性有重要影响的氨基酸,为杀虫机理研究和改造杀虫蛋白提供理论依据,本研究利用Ple Bio Informatique Lyonnais数据库对Cry1Ba3的二级结构进行模拟;采用BioEdit软件分析Cry1Ba3的疏水区;将Cry1Ba3与Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1以及Cry4Ba1进行多序列比对,从而确定了20个氨基酸突变位点。利用半重叠引物PCR的方法对Cry1Ba3进行定点突变,将突变体在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。通过浸叶法对各个突变蛋白杀小菜蛾的生物活性进行测定。获得的20个Cry1Ba3突变体均能在大肠杆菌BL21中表达,并以包涵体形式存在。杀虫活性测定结果表明M6(R192L)、M10(W303A)、M19(H485G)对小菜蛾的活性明显降低,二级结构预测表明活性降低的突变蛋白的构象均发生明显变化,其余17种突变蛋白的活性和二级结构都没有明显变化。说明第192位的精氨酸、第303位的色氨酸和第485位的组氨酸对Cry1Ba3的杀小菜蛾活性有重要影响,上述3个位点氨基酸突变引起的蛋白活性减低可能与毒素的空间结构变化有关。     

钙粘蛋白片段与苏云金杆菌晶体毒素协同作用研究进展

从钙粘蛋白介导苏云金杆菌晶体(Bt Cry)毒素对害虫的毒杀过程、钙粘蛋白重复区和近膜区与Bt Cry毒素的分子间作用涉及的结合位点及可能的互作机制等方面,综述了钙粘蛋白片段与Bt Cry毒素协同作用的最新研究进展。昆虫钙粘蛋白某些片段在非折叠状态时,可与Bt Cry毒素形成寡聚体,从而增加Bt Cry毒素对靶标害虫的毒杀活性。相关研究成果有助于提高Bt Cry毒素毒杀害虫的能力,克服害虫抗药性,具有一定的应用前景。     

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。     

亚洲玉米螟中肠类钙黏蛋白Cry1A毒素结合区对Cry1Ac毒素杀虫活性的影响

通过原核表达及亲和层析获得亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis中肠类钙黏蛋白Cry1A毒素结合区MPR及其在Cry1Ac抗性玉米螟中的突变体MPR-r2多肽片段。采用饲料混合法测定了MPR和MPR-r2及其分别与Cry1Ac毒素混合对亚洲玉米螟幼虫的杀虫效果。结果表明,MPR和MPR-r2多肽片段对亚洲玉米螟幼虫都有一定的杀虫作用;当MPR多肽片段与Cry1Ac毒素混合时,杀虫活性具有加性效应,而MPR-r2多肽片段与Cry1Ac毒素混合的杀虫效果则没有显著提高。     

10种杀菌剂对猕猴桃果实采后青霉病菌的室内毒力测定

[目的]扩展青霉是猕猴桃的重要病害之一,严重影响品质与产量.通过试验,测定10种杀菌剂对猕猴桃果实采后青霉病菌(Penicillium expansum)的毒力.[方法]利用牛津杯法测定不同种杀菌剂对P.expansum的毒力.[结果]所供10种杀菌剂对P.expansum均有一定的抑菌作用,250 g/L丙环唑、95...     

三种杀菌剂对黄瓜内生细菌群落多样性的影响

［目的］ 明确农用链霉素、苯醚甲环唑和代森锌对黄瓜内生细菌群落多样性的影响。［方法］ 采用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术分析3种杀菌剂对黄瓜根、茎、叶的内生细菌群落多样性的影响。［结果］ 黄瓜根、茎中的内生细菌种群比较丰富,而叶片中则较少。3种杀菌剂处理后,黄瓜茎、叶的内生细菌多样性指数减少,根部则有所升高,处理后1~5 d内生细菌的种群变化达到最大,14 d后趋于稳定。T-RFLP分析得出黄瓜根、茎、叶中优势的T RFs片段有222、283、326 bp,可知拟杆菌门,厚壁菌门,α和β变形细菌是优势种群。在叶片中,经杀菌剂处理后有6个T-RFs片段消失（如151、193、203、243、305 bp和326 bp）,可知变形菌门和厚壁菌门中的一些细菌对杀菌剂比较敏感。［结论］ 农用链霉素对内生细菌的多样性影响最大,苯醚甲环唑次之,代森锌的影响最小。杀菌剂对黄瓜叶片的内生细菌群落作用最为直接。     

Response of American sycamore seedlings to maleic hydrazide and sodium chloride

American sycamore (Platanus occidentals L.) seedlings grown in a hydroponics system were treated with a growth regulator, maleic hydrazide (MH) or sodium chloride, or a combination of the two. Application of maleic hydrazide or sodium chloride retarded plant growth, but combined application did not show significant interaction effects. Treatment with both sodium chloride and MH reduced the dry weight of plant tissue to a greater extent than sodium chloride application alone. Elemental analyses of various plant parts revealed that MH was generally without effect on the level of either sodium or chloride ions. In old stem tissue, however, treatment with MH had no effect in the absence of sodium chloride but was associated with lower chloride content in its presence.     

硅对芹菜幼苗乙草胺药害的缓解效应

［目的］ 明确硅对芹菜幼苗乙草胺药害的缓解效果,为除草剂解毒提供依据。［方法］ 在除草剂乙草胺处理下,研究不同浓度的硅对芹菜幼苗生长及生理特性的影响。［结果］ 与对照相比,乙草胺抑制了芹菜幼苗的生长,降低了芹菜的根系活力和叶绿素含量,从而减少了干物质的积累。外施硅可以显著提高芹菜叶片SOD、POD、CAT保护酶活性,缓解了叶片电解质渗漏率及丙二醛含量的快速增加,从而有效缓解乙草胺对芹菜幼苗的影响。施用1.0 mmol/L硅处理20 d时,芹菜干物质积累达到了对照的95.1%;但施用2.0 mmol/L硅,缓解效果则降低。［结论］ 外施一定浓度的硅可以缓解乙草胺对芹菜幼苗生长的影响,但外施浓度过高,缓解效果则降低。     

四川盆地部分地区土壤中苏云金芽胞杆菌分离与cry基因鉴定*

［目的］ 对四川盆地土壤中Bt资源进行研究,了解其分布特点,为我国苏云金芽胞杆菌的储备奠定基础。［方法］ 从四川盆地5个地区采集土样,分离苏云金芽胞杆菌野生菌株。利用PCR RFLP及SDS PAGE方法对Bt分离株进行基因型鉴定和蛋白分析,并对其室内杀虫活性进行初步测定。［结果］ 从207份土样中获得26株苏云金芽胞杆菌野生菌株,出菌率为12.56%。油镜观察可看到球形、方形、菱形及不规则形的伴胞晶体。在21株Bt分离株中检测到cry1、cry1I、cry2、cry9四类基因,且多数菌株都是同时含有多个基因类型,有5株Bt分离株未发现已知基因;SDS-PAGE显示有9株菌株只表达了130 ku的蛋白, 2株只表达了124 ku的蛋白,2株只表达了45 ku的蛋白,6株同时表达了130 ku和60 ku的蛋白, 4株同时表达了124 ku和60 ku的蛋白, 2株同时表达了135 ku和60 ku的蛋白, 1株同时表达了130、90 ku及75 ku的蛋白。毒力测定结果表明：9株菌株对小菜蛾具有高毒力,2株对大猿叶虫有一定的杀虫活性。［结论］四川盆地土壤中Bt资源多样性丰富,其中有2株有一定的研究前景。     

利用蚕豆根尖微核试验研究入侵植物胜红蓟的化感作用潜力

[目的]研究入侵植物胜红蓟(Ageratum conyzoides Linn.)的化感作用潜力。[方法]运用蚕豆(Vicia fabaL.)根尖细胞微核试验研究入侵植物胜红蓟叶、茎、花以及地上部分(除去根以外的植物体,下同)水浸提液的化感效应。[结果]胜红蓟水浸提液具有较强的遗传毒性。在叶、茎、花和地上部分水浸提液作用下,蚕豆根尖细胞有丝分裂指数下降,微核率升高,细胞中出现了微核、染色体桥、染色体环等多种染色体畸变,胜红蓟水浸提液对蚕豆根尖的影响存在显著的浓度效应。胜红蓟叶、茎、花和地上部分的整体效应为叶>茎>花>地上部分,与地上部分相比三部位之间的化感作用潜力不存在简单加和作用,但仍以叶片效应最强。[结论]叶片具有最高的化感作用潜力。     

山西省枣树上啤酒花矮化类病毒的检测及序列分析

［目的］ 从枣树样品中分离鉴定啤酒花矮化类病毒（HSVd）。［方法］ 从山西省农业科学院果树研究所国家枣种质资源圃采集70份枣树叶片样品,提取小分子RNA后通过Northern杂交、RT PCR进行检测,并对阳性样品中的类病毒进行克隆测序,利用生物学软件对所得序列进行分析。 ［结果］ 70份枣树样品中有1份样品感染HSVd,克隆测序后,共获得13条HSVd序列,它们与GenBank上首次报道的HSVd序列相似性为92.6%~92.8% 。［结论］ 本研究首次在国内报道了枣树上分离得到的HSVd序列,HSVd枣树分离物与已报道的HSVd分离物差异较大。     

新蚜虫疠霉感染致病蚜虫的空间分布特征及其理论抽样技术

[目的]探明新蚜虫疠霉的空间分布特点,为进一步研究蚜虫新蚜虫疠霉病害流行规律及田间释放病原菌防治桃蚜提供依据.[方法]调查甘蓝田新蚜虫疠霉感染致病桃蚜密度,采用Taylor幂法与Iwao回归法分析新蚜虫疠霉的空间分布特征.[结果]新蚜虫疠霉在甘蓝田呈聚集分布中的负二项分布,公共K值为2.87.Iwao直线回归方程拟合式为(m*)=0.12+1.36 m(R=0.99),Taylor幂公式为lg(v)=0.35+1.69 lgm (R=0.96).在不同季节,其空间分布的拥挤度差异显著(F=5.34,p＜0.01),7-9月平均拥挤度最高,而1-3月和10-12月最低.精度分别为0.1、0.2、0.3和0.5时的理论抽样数公式分别为n=430.26/x+138.30、n=107.56/x+34.57、n=47.81/x+15.37和n=17.21/x+5.53.当被新蚜虫疠霉感染罹病桃蚜密度较低,即低于每样方5头时,以模型n=17.21/x+5.53较为适宜,在较高密度,即每样方10头/株以上时,以模型n=107.56/x+34.57较宜.[结论]新蚜虫疠霉在甘蓝田均呈聚集分布中的负二项分布,聚集原因是新蚜虫疠霉生物学特性和环境因素.在6-8月,对该菌侵染蚜虫的总体理论抽样以抽查20株左右样方为宜,而在其他季节,抽查30株左右样方为宜.     

甜瓜白粉病内生拮抗细菌的筛选鉴定及其防治效果的研究

［目的］从高抗白粉病的甜瓜品种植株内分离筛选出对甜瓜白粉病有较好防效的内生拮抗细菌菌株,为甜瓜白粉病生物防治探寻新途径。［方法］ 采用温室盆栽试验和叶盘漂浮法分离筛选有较好防效的内生拮抗菌,并对其进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定。［结果］ 从高抗白粉病的甜瓜品种‘MR-1’植株内分离获得31株内生细菌,其中1株内生菌Mg15对甜瓜白粉病盆栽试验防效达到74.3%。在离体叶盘上,经Mg15发酵液处理12 h后白粉菌孢子萌发率仅为9.29%,14 d后产孢量与对照相比降低了60%。扫描电镜观察发现,Mg15发酵液处理后的病菌菌丝皱缩生长,甚至产生畸形。Mg15发酵原液温室防病效果达80.66%。［结论］ Mg15对甜瓜白粉病具有显著防治效果,经鉴定该菌株为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis)。     

进境木材的有害生物幼虫截获风险分析

[目的]我国每年进口大量木材,引起了外来有害生物的传入,其中包含种类繁多的检疫性有害生物幼虫,由于形态特征不明显,难以准确鉴定,增加了我国口岸进境木材的疫情防控压力.摸清由进境木材截获的有害生物幼虫的发生危害特点,并对检疫鉴定手段进行分析,可对进境木材的检疫工作提供参考,有效降低外来有害生物的传入风险.[方法]通过对全...