一种全长cDNA抑制缩减杂交方法及其水稻诱导表达基因分离的应用

以缩减杂交的原理和SMART cDNA合成方法为基础,开发了一种全长cDNA缩减杂交方法.该方法从微量的2个RNA样品合成全长cDNA,经PCR扩增和在两端连接不同的接头,通过2次缩减杂交获得含有高度浓缩的差异表达的全长或较大的基因片段,克隆后筛选出差异表达的基因.以噻菌灵(Probenazole,PBZ)为诱导剂处理水稻,获得了2个上调表达和1个下调表达基因的较长的cDNA片段.     

固相磁珠扣除杂交法筛选奶牛Y-X精子差异表达基因

[目的]筛选出奶牛Y-X精子差异表达基因.[方法]利用固相磁珠扣除杂交技术分选高纯度奶牛Y精子对X精子的表达基因,获得的差异片段经SMART扩增后构建Y精子对X精子消减杂交cDNA质粒库,克隆测序,在线进行序列同源性分析.[结果]筛选出的4条候选基因均与牛EST数据库中的序列高度同源,其中之一确认为牛Sry基因,其余3条牛未知功能基因.[结论]基于磁珠上的固相扣除杂交技术有利于简单快速的富集差异表达基因,可用于筛选奶牛Y-X精子候选差异表达基因.     

棉花蕾铃离层脱落相关基因的克隆及其表达分析

[目的]研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,为解析离层脱落相关基因的表达、调控及功能鉴定提供基础资料.[方法]以50 mg/L赤霉素(GA3)和250 mg/L乙烯利(CEPA)分别处理的棉花蕾铃离层cDNA为Tester,H2O处理的棉花蕾铃离层cDNA为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建经GA3和乙烯处理后的消减文库,反向Northern blo-tting筛选出离层差异表达的EST序列,然后进行基因功能注释与功能分类,并分析蕾铃离层差异表达基因的组织表达模式和GA3诱导表达规律.[结果]以GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为GA文库;以CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为CE文库.从构建的两个消减文库(GA和CE)中共筛选出29个在离层差异表达的EST序列,通过基因功能注释与功能分类,可将这些EST序列分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能等九大类,其中与翻译相关的EST序列占24.14%,说明经激素处理后棉花蕾铃离层有大量的蛋白合成.从消减文库中挑选10个差异表达基因(EST序列)进行RT-PCR分析,结果发现以GA3处理棉花蕾铃离层后部分相关基因的表达模式会发生变化.[结论]棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达,进而影响器官脱落,是其对逆境胁迫反应的结果.     

应用抑制差减杂交法分离粗枝大叶黄杨幼苗的冷诱导表达基因

 应用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建冷诱导表达的正向抑制差减cDNA文库，低温处理的幼苗为tester，常温处理为driver，通过cDNA宏阵列差异筛选cDNA文库，得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84克隆进行DNA测序，去除冗余的cDNA，在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析，共有36个单一序列，有 12 个cDNA未找到同源序列，可能为新基因，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达的基因是可行的。     

棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。     

金鱼头瘤形成相关基因差减文库的构建与分析

采用差减抑制杂交技术(SSH)以1龄红狮头金鱼(Carassius auratus)的头瘤组织为检测子(Tester),40日龄红狮头金鱼幼鱼的头顶上皮组织为驱动子(Driver),构建金鱼头瘤相关基因的差减cDNA文库。以鲫管家基因α-tubilin为参照检测差减效率,结果表明该文库差减效率达210倍,效率较高。随机挑选阳性克隆进行接头特异引物的PCR检测,结果表明插入片段均在0.1~2.0kb之间。利用斑点杂交对PCR检测结果为单一条带的阳性克隆进行筛选并测序,获得高差异性的有效序列93条。通过生物信息学方法对文库序列进行比对、分类和注释,发现若干结缔形成基因和原癌/抑癌基因等与金鱼头瘤形成相关的功能基因,表明cDNA文库构建成功。     

茶树CsH1基因结构及其内含子信息分析

利用cDNA-AFLP方法对低温胁迫下茶树基因表达差异进行了分析,获得1个低温特异表达的cDNA片段。为了获取该片段所代表基因的结构信息,在成功克隆其基因全长cDNA序列(GenBank登录号:EU716314)的基础上,设计引物,从茶树品种‘龙井43’的叶片中克隆获得了该基因全长DNA序列,命名为茶树CsH1基因(JF836005)。基因结构分析表明:CsH1基因包含2个外显子和1个内含子,外显子和内含子的剪接符合GT-AG原则,其中2个外显子的碱基序列长度分别为236 bp和608 bp,内含子为388 bp。经序列分析发现该内含子具有启动子及激素调控元件,可能对CsH1基因的特异性表达有调控作用。茶树CsH1基因的结构及其内含子信息为茶树低温特异基因的表达和抗寒途径分子调控提供了序列信息。     

亚麻LusiCesA1上调基因表达研究

研究通过克隆亚麻纤维素合成酶Lusi Ces A1基因,利用抑制差减杂交(SSH)技术,以DIANE Lusi Ces A1基因敲除RNA为Tester,常规RNA为Driver,构建亚麻纤维素合成酶c DNA文库,逆向斑点杂交验证阳性克隆,筛选差异表达克隆,鉴定出Lusi Ces A1上调表达增强基因122个,其中95个与已知功能基因同源,其余27个未知同源序列推断为亚麻纤维素合成途径新基因。Lusi Ces A1是亚麻纤维素合成途径关键酶基因,通过其上调表达作用机理分析,挖掘纤维合成过程上调表达基因,可改良亚麻品种。     

低温诱导甜菜(Beta vulgaris L.)抽薹相关基因的RACE分析

采用cDNA的末端快速扩增(Rapid amplificationn of cDNA ends)技术,以代表性差异分析cDNA-RDA(Representational difference analysis of cDNA)技术获得的低温诱导甜菜茎尖中差异表达的基因片段为模板,进行巢式PCR扩增,然后根据RACE拼接结果合成引物,分别以低温诱导的cDNA和DNA为模板进行PCR扩增,克隆测序后获得1个全长609 bp的cDNA和855 bp的DNA,分别命名为Ty7Br600和Ty7Br900,在GenBank注册,登录号分别为AY324115和AY324114。在GenBank库中的核苷酸序列比较未发现它们的同源序列,因此认为这个cDNA序列可能是甜菜的一个新基因。     

欧洲油菜花粉cDNA文库的构建

从欧洲油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）成熟花粉中提纯出ｍＲＮＡ．ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ在ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）引导下，用反转录酶合成ｃＤ－ＮＡ第一链，用大肠杆菌ＲＮＡ酶Ｈ和大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ置换合成ＣＤＮＡ第二链．加上ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ接头。最后将双链ＤＮＡ克隆子λｇｔｌｌ载体中。用Ｂｃｐｌ作探针，杂交筛选构建的ｃＤＮＡ文库。     

华东葡萄抗白粉病基因差异表达cDNA克隆与序列分析

为筛选和克隆华东葡萄抗白粉病相关基因,以高抗葡萄白粉病的华东葡萄株系白河-35-1为材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术进行在白粉病病原菌诱导下抗白粉病差异表达基因的研究,筛选出适宜DDRT-PCR的引物组合184对,获得抗白粉病差异表达的cDNA片段13个,序列分析结果显示其功能分别涉及转录调控、能量代谢、蛋白合成、防御反应等生理生化过程,表明华东葡萄白河-35-1抗白粉病是诸多代谢途径相互协调作用的结果。这些差异片段的获得为探明葡萄抗白粉病分子机制提供了前期理论基础。     

一步法快速纯化mRNA

介绍一种针对 Ｒ Ｎ Ａ、ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的理化及生物学特性，在酸性胍一步抽提法基础上加以改进，并配合ｏｌｉｇｏ （ｄ Ｔ）） 纤维素亲和层析法纯化提取ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的方法， 此法具有简便、经济、快速、重复性好等多种优点。本实验通过对 Ｈｅｌａ 细胞、兔脾脏组织、菜豆苗ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的分离提取， 并运用甲醛变性凝胶电泳及分光光度计检测， 证明采取此法所获得的ｍ Ｒ Ｎ Ａ 完全符合实验要求， 可广泛应用于ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库的建立、核酸探针制备、逆转录 Ｐ Ｃ Ｒ 多项生物学技术。     

感染甘蔗花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库的构建及评价

为了研究甘蔗(Saccharum officinarum L.)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的互作机制,构建感染SCMV的甘蔗叶片的酵母双杂交cDNA文库。以热带种Badila为供试材料,提取感染SCMV植株的叶片总RNA,分离纯化获得mRNA,通过反转录反应合成3种读码框的双链cDNA。用Gateway技术,通过BP和LR反应,将cDNA迅速重组到酵母双杂交载体pGADT7-DEST上,构建酵母双杂交文库。结果表明,文库容量为2.0×107cfu,随机挑取24个克隆检测,重组率为100%,cDNA插入片段长度主要分布在1kb~2kb,文库质量较好。说明该文库的构建为筛选与SCMV互作的甘蔗寄主因子基因,研究甘蔗与SCMV的互作机制及甘蔗抗花叶病育种奠定基础。     

长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的构建

为了克隆和研究具有免疫原性的长角血蜱基因,应用建库试剂盒成功构建了长角血蜱雌蜱唾液腺cD-NA表达文库.在无Rnase污染的环境下摘取半饱血长角血蜱雌蜱唾液腺,并从中提取RNA,进而纯化mRNA,利用oligo(dT)引物反转录合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并酶切,过柱分级分离后,将cD-NA分子定向连接到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体中.经体外包装转染E.coliERl647宿主菌,进行文库容量测定和扩增.以扩增文库的DNA为模板,利用载体通用引物检测cDNA文库中插入片断的大小和质量.经检测,所构建长角血蜱cDNA文库的基础库容量约为4.2×106pfu/mL,插入片段主要集中在300~2 000 bp之间,说明文库质量高、代表性强.     

陆地棉黄萎病菌诱导抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

为探明棉花黄萎病抗性的相关基因,对本实验室的一个高抗黄萎病陆地棉材料进行抑制消减杂交(SSH),以黄萎病菌诱导后48 h和未诱导的植株分别作为Tester和D river,提取总RNA并分离mRNA,通过合成cDNA双链及两次PCR扩增,富集诱导后植株中差异表达的片段。对两次PCR后的产物纯化,连接并转化到大肠杆菌中完成文库构建,共获得了434个阳性克隆。对插入片段进行PCR扩增后发现大小从0.45 kb到0.70 kb不等。指纹图谱分析将所有克隆分为20类,于每一类中取1个克隆进行测序分析。BLAST分析表明大部分克隆片段与其他病原菌诱导缩减库中的EST相似。缩减片段编码的蛋白与拟南芥的P450单加氧酶、病程相关蛋白、类甜蛋白以及几丁质酶等相似。此cDNA文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离抗黄萎病基因奠定了基础。     

吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选

 【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo（dT）引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106 PFU,扩增文库的滴度为8.2×108 PFU?ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。     

紫外线胁迫的花生幼果cDNA文库构建与RS cDNA的分离

紫外线胁迫可导致花生产生白藜芦醇的诱导合成防御反应,本研究在利用UV处理花生幼果、激发花生幼果防御反应的基础上提取总RNA,应用SMART-cDNA文库构建试剂盒构建了花生幼果的cDNA文库.该文库含有1.0×106独立克隆,插入片段平均1 kb左右.利用所构建的cDNA文库,采用96孔板PCR筛选方法,分离获得2个白藜芦醇合成酶cDNA.