水牛卵母细胞体外成熟研究

本试验探讨了激素、卵泡液及颗粒细胞共培养对水牛卵母细胞体外成熟的影响.试验表明,当体外成熟培养液中含有3 μg/ mL FSH时,随着LH添加量的增加,水牛卵母细胞的第一极体排放率和成熟率逐渐提高;添加30 μg/ mL LH水牛卵母细胞的第一极体排放率(26.67 %)和体外成熟率(40.00 %)均显著(P＜0.05)提高.在含有激素的成熟培养液中添加10 %的卵泡液,水牛卵母细胞的第一极体排放率(52.33 %)和成熟率(66.28 %)均进一步显著(P＜0.05)提高.颗粒细胞单层共培养对水牛卵母细胞的第一极体排放率(49.21 %)和成熟率(65.08 %)有提高,但没有统计学意义.在本试验条件下,综合以上成熟培养条件可获得60.61 %的第一极体率和72.73 %的成熟率.     

亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响

收集屠宰场水牛卵巢卵母细胞,在卵子体外成熟和受精后胚胎体外发育过程中分别添加0(对照组),10,50,100和200μmol·L-1的亚麻酸,探究亚麻酸对水牛卵母细胞核成熟率、受精卵的分裂率和植入前胚胎体外发育的影响。结果显示:在水牛卵母细胞体外成熟液中添加亚麻酸,添加浓度50μmol·L-1组的核成熟率(74.18%)显著高于对照组和其他实验组(P0.05),囊胚率(33.24%)显著高于对照组和10μmol·L-1亚麻酸组(P0.05)。在胚胎培养液中添加50μmol·L-1亚麻酸组的囊胚率(34.52%)显著高于对照组和100μmol·L-1亚麻酸组(P0.05);同时在成熟液和胚胎培养液中添加亚麻酸,添加浓度200μmol·L-1组的分裂率显著高于对照组(P0.05),而各组间的囊胚率和D7囊胚比率均差异不显著。结果表明,单独在水牛卵母细胞体外成熟液和胚胎培养液中添加50μmol·L-1亚麻酸能有效促进水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育。     

磷酸二酯酶抑制剂对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

哺乳动物有腔卵泡中的卵母细胞在体外会自发恢复减数分裂,适当延迟减数分裂的自发恢复,能促进核与胞质成熟的同步化,有利于后续胚胎的发育。本试验研究了磷酸二酯酶3(PDE 3)特异性抑制剂milrinone对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。结果表明,milrinone抑制山羊卵母细胞体外成熟的时间为6 h,其最佳剂量为100μmol/L,经milrinone处理体外培养28 h成熟的山羊卵母细胞用于孤雌激活,能显著提高孤雌激活胚的卵裂率及囊胚率。说明成熟培养液中添加适当剂量的milrinone,能显著提高体外成熟的山羊卵母细胞的质量。     

EGCG对水牛卵母细胞体外成熟的影响

[目的]探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对水牛卵母细胞体外成熟质量与早期胚胎发育能力的影响,为优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率提供参考.[方法]在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG,以排出第一极体为细胞核成熟标志,观察卵母细胞核成熟情况,检测MⅡ期卵母细胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,并统计经孤雌激活及体外受精后早期胚胎的发育情况.[结果]在体外成熟液中添加10~20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展,卵丘扩展指数(CEI)分别为2.49%和2.42%,卵母细胞成熟率(59.31%和50.98%)显著高于未添加EGCG的CK组(P<0.05,下同),MⅡ期卵母细胞的GSH含量(3.21和3.25 pmol/枚)也显著高于CK组;添加20~30 μmol/L EGCG可显著降低水牛MⅡ期卵母细胞的ROS水平.以体外成熟培养获得的水牛MⅡ期卵母细胞分别进行孤雌激活及体外受精,结果发现以在体外成熟液中添加10μmol/LEGCG的效果最佳,其对应的卵裂率和囊胚发育率均显著高于CK组.[结论]EGCG可用于优化水牛卵母细胞体外成熟体系,能有效提高卵母细胞的成熟率和体外发育潜力,且以水牛体外成熟液中添加10μmol/LEGCG的效果最佳.     

瘦素对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎发育的影响

[目的]探讨瘦素在水牛体外胚胎生产体系中的作用机理,提高体外胚胎生产效率,为利用分离精子加速水牛品种改良及良种群的扩繁奠定基础.[方法]分别在水牛卵母细胞成熟培养液和胚胎培养液中添加瘦素,研究其对水牛卵母细胞体外成熟率和体外受精胚胎发育率的影响.[结果]在水牛卵母细胞体外成熟液阶段,添加瘦素不仅能促成熟,还能提高其胚胎发育潜能;在体外受精后的胚胎培养阶段,添加瘦素也能显著提高囊胚发育率,二者的最佳瘦素浓度均为10 ng/mL.在最佳瘦素浓度(10 ng/mL)下,常规精子体外受精后的囊胚发育率从19.7%(空白对照组)提高到27.0%,分离精子体外受精后的囊胚发育率从12.3%(空白对照组)提高到17.4%.[结论]瘦素能促进水牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育,并以添加10 ng/mL瘦素的促进效果最明显.     

不同浓度的牛血清及牛血清白蛋白对水牛卵母细胞体外成熟的影响

探讨不同浓度的牛血清及牛血清白蛋白对水牛卵母细胞体外成熟的影响,摸索出水牛卵母细胞体外成熟最佳的血清及其浓度。共进行了2个试验,试验1结果表明,10%FCS,20%FCS和10%ECS的成熟率(55.6%,59.4%,62.8%)均显著高于对照组(48.5%)。试验2结果表明,0.25%BSA和0.5%BSA的成熟率(56.7%,53.9%)显著高于对照组(44.7%),但添加0.25%BSA和0.5%BSA的水牛卵母细胞体外成熟率无显著差异。     

山羊卵泡卵母细胞体外成熟体外受精研究

对山羊孵巢卵泡卵母细胞的采集方法、 PMSG处理山羊促进多卵泡发育及受精体系进行了研究。结果表明：切割法获可用卵数高于抽吸法， PMSG处理获卵总数及可用卵数高于对照组， BO液法的受精率高于 TALP液法，而 TALP液法的桑椹胚率高于 BO液法。     

牛卵母细胞体外成熟及体外受精的研究

本研究分析了卵巢不同性周期阶段（卵泡期、黄体期）、外源激素（ＦＳＨ、ＬＨ、雌激素）和不同卵泡液浓度（１０％,２０％,３０％）对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,卵巢的不同性周期阶段对卵母细胞体外成熟的影响不大（６３９％和５８７％）;成熟培养基中添加ＦＳＨ（１０ｍｇ／Ｌ）,ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）和同时添加ＬＨ、雌二醇（１ｍｇ／Ｌ）,可以促进卵母细胞的体外成熟,成熟率分别为６３０％,６４０％,６９１％;卵泡液（１０％,２０％,３０％）代替血清,其成熟率分别为５０７％,５７６％,５１９％,２０％ｂＦＦ效果最好。本研究对精子的两种处理方法进行了比较,发现在相同精子密度条件下（１×１０６～２×１０６个／ｍＬ）,Ｐｅｒｃｏｌ液处理精子的受精率（４７１％）显著低于上浮法处理精子的受精率（５７１％）（Ｐ＜００５）。     

体外成熟猪卵母细胞的体外受精研究

实验采用体外成熟的猪卵巢卵母细胞，将鲜精以前培养结合咖非因法获能后进行ＩＶＦ实验．体外成熟卵ＩＶＦ后的卵裂率为２４．７％～３８．４％，与目前文献报道的近似；授精时精子浓度为２×１０５／ｍＬ，１×１０６／ｍＬ和５×１０６／ｍＬ体外受精后的卵裂率分别为４０．８％（８２／２０１）．４５％（８５／１８９）和３０．５％（５０／１６４）．前二者无显著差异，但都与最后一组差异显著．我们认为，在本实验条件下，体外受精时适当的精子浓度要比目前常用的１×１０６／ｍＬ低．我们将肝素结合咖啡因的精子在能方法与前培养结合咖啡因法进行了比较，卵裂率分别为１０．７％（９／８４）和４０％（３２／８０），前者虽然在牛体受精实验中很成功．但在猪效果差．将体外成熟体外受精卵移入同步的受体猪输卵管后．有一头母猪成功地产下了５只“试管猪’，存活３只．     

牛卵巢卵母细胞体外成熟的研究

研究了卵巢采卵方法以及卵巢保存温度和时间、性周期阶段、激素和培养基对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:从屠宰场获取的卵巢,先切剖或抽吸卵泡再切割卵巢,可显著提高可用卵母细胞数。卵巢保存时间在 2 h 以内最好,最长不超过 6 h。30~39 ℃的生理盐水保存卵巢,卵母细胞的成熟率(63.9 %)和卵裂率(34.4 %)均显著高于 2~8 ℃(16.7 %、0 %)和 20~29 ℃(54.1 %、31.7 %)保存的。采集卵母细胞时卵巢所处性周期阶段(卵泡期、黄体期)对卵母细胞体外成熟的影响不大(成熟率分别为 69.2 %、64.3 %)。M199 是牛卵母细胞体外成熟理想的培养基,M199 + 50 IU/mL LH+ 100 IU/mL FSH + 1μg/mL 17?-E2和 M199 + 50 IU/mL GnRH+1μg/mL 17?-E2都是牛卵母细胞体外成熟理想的培养系统(成熟率分别为 69.4 %、67.5 %,卵裂率分别为 35.4 %、42.7 %)。     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。     

山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精

从屠宰场采集卵巢。抽吸法回收2～6mm大腔卵泡卵母细胞。随机抽样后,测量其直径为167.42±17.43μp。A,B级卵泡卵母细胞进行体外成熟培养,其成熟率为67.50％。山羊新鲜精液以BO液或MD-H液处理后,与体外成熟卵母细胞进行授精,受精率分别为56.61％（17／30）和63.33％（19／30）,两组间差异不显著（P＞0.05）。BO和MD-H液均适宜于山羊精子获能处理。体外受精卵的2细胞胚发育率为16.67％（6／36）,4细胞胚发育率为2.78％（1／36）。     

辽宁绒山羊卵泡卵母细胞体外成熟的分析

为了获取高质量的卵泡卵母细胞,提高绒山羊体外胚胎生产的效率,采用切割法与抽吸法采集卵泡卵母细胞,并对获得的可用卵母细胞进行了体外成熟培养,表明结果:切割法获得的可用卵母细胞较多,明显增加了用于体外成熟的卵母细胞数。在温度37.0、38.0、39.0℃条件下对卵母细胞进行体外成熟培养,成熟率分别为67.74%、72.00%、75.38%,表明39.0℃适合辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟培养。在温度39.0℃条件下用10%胎牛血清(FCS)的TCM-199培养液培养卵母细胞的成熟率为78.57%,而在10g/LBSA的TCM-199培养液中培养卵母细胞的成熟率为74.07%,二者差异不显著。     

屠宰山羊卵母细胞的体外成熟培养

屠宰白山羊卵巢在２５～３５℃下于２～３小时运回实验室。每个卵巢获可培养卵丘细胞－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）０４２个（１９３４５６）；可培养ＣＯＣ在Ｍ１９９＋ｈＣＧ１ＩＵｍｌ＋１７－β－雌二醇１μｇｍｌ＋牛血清白蛋白１０ｍｇｍｌ＋庆大霉素５０ＩＵｍｌ的培养微滴中于５％ＣＯ２、空气、饱和湿度或标准气（５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）、饱和湿度，３９℃培养２４～２６小时，卵母细胞成熟率为９０３％（１８６２０６）。成熟卵母细胞体外受精率为７１５％（１３３１８６）。结果表明此培养系统适合于屠宰白山羊卵母细胞的体外成熟培养     

猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率影响因素分析

 研究了月龄和卵巢采集后的保存条件对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率的影响 ,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。试验包括 :(1)卵巢保存的生理盐水温度 (2 2、30、37、38.5、4 0℃ )对猪卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响。 (2 )卵巢保存时间对猪卵母细胞体外成熟和后期发育的影响。 (3)初情期前后母猪卵母细胞对体外成熟和发育潜力的影响。结果表明 ,(1) 38.5℃保存的卵巢卵母细胞激活后的卵裂率 (79.6 4 % )和囊胚率(18.11% ) ,37℃的卵裂率 (76 .18% )和囊胚     

猪腔前卵泡卵母细胞体外成熟培养初探

【研究目的】为了进一步挖掘猪的遗传潜力,为体外受精、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究提供大量优质卵源。【方法】以极体排出情况为判断标准,采用一步法和两步法成熟培养猪腔前卵泡卵母细胞,来考察猪腔前卵泡卵母细胞最佳成熟方式。【结果】采用任何一种方法卵母细胞经体外成熟后都没有达到MⅡ。然而,腔前卵泡体外培养5d后,分离出的卵丘卵母细胞复合体再培养12d,卵母细胞平均直径达到102.68μm(102.68±12.21),接近正常成熟卵母细胞的体积,为卵母细胞的成熟创造了条件。【结论】用两步法培养猪的腔前卵泡,其卵母细胞能够达到接近正常成熟卵母细胞的体积,说明采用两步法培养猪腔前卵泡卵母细胞是可行的。     

IGF-I、TGF-α、bFGF对猪卵母细胞体外成熟和卵裂的影响

 研究了IGF-I、bFGF、TGF-α 3种细胞因子单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后卵裂的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。结果表明，3种细胞因子对卵母细胞的成熟和激活后卵裂呈现双重效应（1）20 ng·ml-1的IGF-I的成熟率和卵裂率显著的高于对照组和10、30、40、50、100 ng·ml-1组[（85.3 ±2.11) %，（85.4±2.81）%；（71.1 ±1.91）%，（62.5 ±0.98）%；（77.5 ±2.5）%，（59.1 ±3.93）%；（61.9 ±1.72）%，（54.3 ±3.48）%；（58.6 ±4.26）%，（53.1 ±1.23）%；（44.4 ±5.10）%，（49.8 ±3.55）%；（33.9 ±3.48）%，（46.1 ±3.59）%，P <0.05)，当IGF-I的浓度达到100 ng·ml-1时,成熟率（33.9±3.48）%和卵裂率（46.1±3.59）% 降低，与其它各组相比差异显著（P < 0. 05）。（2）20 ng·ml-1的bFGF的成熟率（85.0 ±1.70）%和卵裂率（85.0±2.82）%最高,和其它各组相比,差异显著（P < 0.05）。（3）15 ng·ml-1的TGF-α的成熟率（86.9±0.46）%和卵裂率（86.3±2.01）%最高,和其它各组相比,差异显著（P < 0.05）。（4）15 ng·ml-1TGF-α和20 ng·ml-1bFGF联用组，卵母细胞成熟率和分裂率显著高于20 ng·ml-1 bFGF和20 ng·ml-1 IGF-I联合组；15 ng·ml-1TGF-α和20 ng·ml-1 IGF-I联合组；与20 ng·ml-1 bFGF、20 ng·ml-1 IGF-I和15 ng·ml-1 TGF-α三者联用组。[（89.2±1.44）%和（88.8±0.17）%.（75.6±0.98）%和（78.3±1.65）%；（77.2±2.54）%和（80.2±2.26）%；（76.4±1.28）%和（77.4±3.73）%，P <0.05]。     

牛卵泡卵母细胞体外成熟的研究

研究了ＦＣＳ,１７β－Ｅ２,ＦＳＨ,ＬＨ对牛卵泡卵母细胞成熟的作用及培养时间对卵母细胞核和细胞质成熟的影响。结果表明,添加体积分数为１０％～１５％的ＦＣＳ,１～２ｍｇ·Ｌ－１１７β－Ｅ２,２０～５０ｍｇ·Ｌ－１ＬＨ和１０ｍｇ·Ｌ－１ＦＳＨ有利于提高卵母细胞核成熟,放出第一极体。而成熟培养２０,２４ｈ的卵母细胞成熟率显著高于培养１６ｈ（Ｐ＜０．０５）,核成熟后培养３～４ｈ有利于卵母细胞质成熟,对其后的受精、卵裂及胚胎的进一步发育有重大影响。且ＴＣＭ１９９＋质量分数１０％～１５％的ＦＣＳ＋１～２ｍｇ·Ｌ－１１７β－Ｅ２＋１０ｍｇ·Ｌ－１ＦＳＨ＋２０～５０ｍｇ·Ｌ－１ＬＨ是卵母细胞成熟的理想培养系统。