辣椒水通道蛋白基因CaTIP1-1启动子的克隆及序列分析

利用巢式PCR技术,分离获得CaTIP1-1基因上游1749 bp的片段。利用Plant CARE软件预测发现该序列含有启动子典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及非生物胁迫相关的元件和光应答元件。以PBI121载体为基础,构建CaTIP1-1启动子驱动下绿色荧光蛋白GFP报告基因植物表达载体。利用叶盘法转化烟草获得转基因植株,通过荧光显微镜能够检测到T1代烟草悬浮细胞系能够稳定表达荧光。结果表明该启动子具有驱动绿色荧光蛋白表达的活性。     

激素和非生物胁迫对月季RhPIP1;1 启动子活性的调节作用

 通过反向PCR 方法克隆得到月季（Rosa hybrida L.）‘萨蔓莎’质膜型水孔蛋白基因RhPIP1;1 上游2 126 bp 的启动子序列。PLACE 分析发现，RhPIP1;1 启动子序列中含有GA、ABA 和乙烯等激素诱 导相关顺式作用元件及干旱、低温和盐胁迫等非生物胁迫相关顺式作用元件。在RhPIP1;1promoter：：GUS 转基因拟南芥中发现，RhPIP1;1 启动子活性与植株发育进程相关；几乎所有器官均可检测到GUS 表达， 而且在迅速扩展的器官以及叶片和花的维管组织中尤为强烈。同时在6 d 和9 d 苗龄的转基因植株中，GA 处理上调了莲座叶中RhPIP1;1 启动子的活性，而ABA、甘露醇、NaCl 和冷处理分别下调了莲座叶和根 中RhPIP1;1 启动子的活性。将RhPIP1;1 启动子不同长度的5′端缺失片段融合GUS 基因，并在烟草叶片 中瞬时表达，缺失–580 ~–256 之间的324 bp 片段后，启动子活性显著降低。研究结果表明RhPIP1;1 启 动子对多种激素和非生物胁迫存在响应，并且这种响应具有发育和器官特异性；RhPIP1;1 启动子中–580 ~ –256 区段对于启动子活性具有重要的作用。     

甜樱桃砧木PcMPK3基因启动子的克隆及对病原菌感染的响应

【目的】探明PcMPK3基因的表达调控规律。【方法】利用染色体步移技术从甜樱桃矮化砧木Gisela 6中克隆PcMPK3基因的启动子序列PcMPK3pro。利用Neural Network Promotor Prediction、softberry、PLACE和PlantCARE网站在线预测PcMPK3基因的基础启动子、转录起始位点和顺式作用元件。将PcMPK3pro定向替换植物表达载体pBI121-SN1的CaMV35S组成型启动子,构建重组表达载体pBI-PcMPK3pro:GUS,瞬时转化烟草叶片。【结果】结果表明,PcMPK3pro含有启动子核心元件TATA-box和CAAT-box等多种响应胁迫的顺式作用元件。受病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000)侵染,PcMPK3pro能驱动GUS报告基因表达且GUS酶活性显著提高。【结论】推测PcMPK3基因参与植物响应病原菌感染的胁迫过程。     

柑橘CsTBL1启动子的克隆及其在转基因拟南芥中的活性分析

以奥林达夏橙[Citrus sinensis(L.)‘Olinda’]为材料,克隆了CsTBL1基因编码起始位点上游长度为2 361 bp的启动子序列。生物信息学预测表明,该启动子中含有多个与逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析CsTBL1启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用浸花法转化拟南芥,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性染色。结果显示,CsTBL1启动子在1～3 d龄幼苗所有组织中的活性都非常强,在7～20 d龄幼苗的子叶和根中的活性仍然较强,但在下胚轴中基本检测不到活性。在50 d龄幼苗中,只在叶、茎的毛状体以及还在生长的根中检测到GUS活性。转基因植株的GUS表达受到1–氨基环丙烷–1–羧酸(乙烯合成前体,ACC)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导。上述结果表明CsTBL1可能在植物发育和抗外界逆境胁迫中起到非常重要的作用。     

山梨B-box基因PuBBX24表达特性及其在童期调控中的功能分析

为了解PuBBX24基因在梨生长发育过程中的功能,以山梨(Pyrus ussuriensis Maxim.)实生苗为试材,分离PuBBX24及其启动子序列,qRT-PCR分析PuBBX24在山梨根、茎、花、叶片以及果实中的表达特性,对启动子顺式作用元件进行预测,获得PuBBX24启动子驱动GUS基因表达的转基因拟南芥并进行不同组织、不同生长发育阶段,以及ABA、非生物胁迫和不同光处理下PuBBX24基因启动子活性分析,同时在拟南芥中异源表达PuBBX24并验证其功能。结果表明,PuBBX24在山梨根、茎、叶、花以及果实中均有表达,但在茎中表达量最高,叶片表达量最低,且在由童期向成年期发育的叶片中表达水平逐渐降低。PuBBX24上游启动子序列中包含一系列响应激素、光、胁迫等顺式作用元件。而PuBBX24启动子驱动的GUS基因主要在转基因拟南芥叶片、下胚轴以及萼片中表达,且在叶片中的表达水平随童期向成年期的发育而逐渐降低,在根中表达不均匀,在柱头和花柄中表达水平较低,在角果中未检测到GUS活性。PuBBX24启动子显著响应ABA、光、低温、渗透以及盐胁迫处理,且PuBBX24的过量表达影响了转基因拟南芥植株童期—成年期阶段转变进程。这些结果表明,山梨PuBBX24可能参与ABA、光以及胁迫响应,同时在童期—成年期阶段转变过程中起负调控作用。     

苹果SUPERMAN家族基因的组织特异表达及MdSUP3的功能分析

通过半定量RT-PCR分析SUPERMAN家族基因在‘富士’苹果（Malus × domestica Borkh.‘Fuji’）叶芽、幼叶、花芽、花蕾、花、皮部组织和幼果中的表达模式,通过MdSUP3自主启动子驱动的GUS基因表达和MdSUP3异位表达分析其功能。结果表明,MdSUP3、MdSUP11和MdSUP9a在所检测的组织器官中均有表达,MdSUP9b主要在营养器官中表达,MdSUP5a、MdSUP1b主要在生殖器官中表达。MdSUP3启动子驱动GUS基因在植株根尖、幼叶、幼茎和花等器官中表达。超表达MdSUP3的转基因烟草植株矮化、节间缩短、叶片卷缩、花器官颜色改变和部分花器官形态异常;与对照相比,转基因烟草中ABA合成酶基因NtNCED3-2,花青素合成途径的NtDFR2和NtANS1基因表达显著上升,细胞分裂素氧化酶基因NtCKX和赤霉素氧化酶基因NtGA2ox4表达显著下降。异位过量表达删除C端DLELRL基序的MdSUP3基因不影响转基因烟草的生长发育,证明DLELRL是基因必不可少的功能域。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

银杏查尔酮合成酶基因启动子（GbCHSP）调控元件及功能分析

通过染色体步移方法从银杏（Ginkgo biloba L.）基因组中克隆到查尔酮合成酶基因（CHS）翻译起始位点上游1 711 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在多个顺式作用元件,包括紫外/蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、MYB结合位点、TATA-box和CAAT-box等。亚克隆了CHS转录起始位点上游1 402 bp序列,将其与GUS基因构建融合表达载体pBI121 + CHSP,以pBI121-35S作为负对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法分别转入烟草。结果表明,银杏CHS启动子序列能驱动GUS基因在烟草中的表达,表达具有组织特异性。GbCHSP的功能研究将有助于揭示银杏叶黄酮的积累与GbCHS基因表达的分子机理。     

‘嘎啦’苹果MYB12基因启动子的克隆与功能分析

以‘嘎啦’苹果基因组为模板,用PCR方法扩增得到苹果MYB12基因启动子(ProMYB12)。利用在线分析网站Plant CARE和PLACE对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测。构建pCAMBI0390-ProMYB12-GUS植物瞬时表达载体并转化农杆菌,瞬时转染野生型番茄Micro-Tom(Lycopersion esculentumcv.Micro-Tom)用以研究启动子的启动活性。结果表明:克隆获得的启动子长度为1 290bp。启动子序列中存在大量的顺式作用元件,既有转录必备的TATA-box和CAAT-box,也存在非生物胁迫和植物激素响应元件以及大量的光调控元件,此外还存在一些组织特异性表达元件。‘嘎啦’苹果MYB12启动子驱动的GUS基因在番茄的花和种子处有较高的表达量,表现出一定的组织特异性。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究

 为进一步明确甜瓜果实软化的分子机理,构建了ACC氧化酶Ⅰ基因（CmACOⅠ）启动子与GUS基因融合的植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法转化甜瓜‘甘甜一号’。通过卡那霉素抗性和 PCR检测筛选呈阳性的转化植株,取不同组织进行X-Gluc染色。结果表明,转化植株的根、茎、叶、花、果实等器官组织经X-Gluc染色后,只在花药组织和成熟果果皮中出现蓝色斑点,其余组织均未检出,表明甜瓜CmACOⅠ启动子能够驱动GUS基因在转基因甜瓜花药和成熟果果皮中特异表达。     

异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达

为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子,构建GRP、Rolc、RSSl异源韧皮部特异启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色分析表明,3个启动子均显示了维管束组织特异性。其中,GRP启动子活性强,且具有严格的韧皮部组织特异性;Rolc启动子活性最强,在根和茎中呈组成型表达;RSSl启动子活性最弱。Real-time RT-PCR和GUS酶活性分析进一步证明了GRP启动子具有较强的韧皮部组织特异性,该启动子有望应用于柑橘抗黄龙病基因工程育种。     

芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析

在已经克隆的‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁二氢黄酮醇4–还原酶（DFR）基因的基础上,通过染色体步移法从两种芜菁基因组中克隆了BrDFR1和BrDFR2基因上游1 296和1 297 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,启动子片段中包含TATA box、CAAT box、光调控元件、ABA应答元件、伤害应答元件、低温应答元件、防御与胁迫应答元件、MeJA应答元件等多个顺式作用元件。启动子BrDFR1P和BrDFR2P仅在15个核苷酸位点存在差异。将BrDFR1P和BrDFR2P分别连接到pCAMBIA1301植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,通过农杆菌介导遗传转化烟草。GUS组织化学染色检测表明,BrDFR1P和BrDFR2P均能驱动GUS基因表达。构建BrDFR1P和BrDFR2P的一系列缺失体,融合GUS基因后遗传转化烟草。染色结果表明,BrDFR1P和BrDFR2P缺失片段均具有相应的起始下游基因转录的活性特征。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

菜薹BcAMT1;4启动子的克隆及活性分析

以菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）为材料,利用染色体步移法获得了铵转运蛋白基因BcAMT1;4的ATG上游长度为2 086 bp的启动子序列。生物信息分析表明,该启动子中包含多个光信号、激素信号、逆境应答、组织特异表达等顺式作用元件。构建该启动子与GUS基因的融合表达载体,并用农杆菌介导法转化拟南芥。通过对T3代转基因拟南芥植株GUS活性分析发现,GUS染色主要集中于叶片,而在根、茎、花中染色较浅。此外,不同氮源也影响BcAMT1;4启动子的活性,缺氮处理提高了转基因拟南芥GUS表达活性,而分别供0.25 mmol ? L-1 NO3-、NH4+和NH4NO3的处理在一定程度上抑制其表达活性。研究结果表明,BcAMT1;4可能对菜薹叶片铵态氮营养具有重要调控作用。