杧果MiPGP1和MiPGP2的表达分析及其对拟南芥不定根形成的影响

杧果子叶切段不定根仅在靠近胚轴端的切面上形成,而在远离胚轴端的切面上则没有不定根形成,前期研究表明生长素极性运输可能在这个过程中起着重要作用,但生长素极性运输载体基因PGP在其中的作用机制尚不清楚。以‘粤西1号’杧果(Mangifera indica L.‘Yuexi 1’)子叶切段为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到了2个生长素极性运输载体基因(MiPGP1和MiPGP2)的cDNA及基因组DNA全长。MiPGP1和MiPGP2的cDNA全长分别为4 650和4 107bp,其开放读码框长度分别为4 092和3 851 bp,分别编码1 363和1 289个氨基酸;其基因组DNA全长分别为6 430和5 747 bp,从起始密码子到终止密码子的长度分别为6 082和5 633 bp。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示MiPGP1和MiPGP2属于多重抗药性/磷酸糖蛋白家族。荧光定量PCR结果表明,MiPGP1和MiPGP2在杧果子叶切段不定根形成过程中,在近胚轴端(生根端)和远离胚轴端(非生根端)都有表达,0 h时生根端和非生根端表达量都比较低,培养6h后二者的表达量都显...     

苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性

 根据已报道的植物铁结合蛋白基因( ferritin) 的保守区域设计引物, 用RT2PCR 的方法从‘嘎拉’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因cDNA共有1 043个碱基, 其中编码区834bp, 编码277个氨基酸残基的蛋白质, 终止密码子后有209 bp左右的3’端尾随序列区。Southern杂交结果显示ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5 mmol·L ^{- 1}的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗不同时间后的定量RT-PCR分析表明, ‘嘎拉’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达量增加, 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。     

冬枣两个乙烯受体编码基因的克隆及序列分析

 根据植物乙烯受体ETR1家族氨基酸和核苷酸的保守区序列设计简并引物, 通过RT2PCR从半红期冬枣果实中分离了两个1 058 bp的乙烯受体cDNA片段。在分析已知序列基础上, 分别通过3′RACE及对两个基因上游5′端编码区的扩增, 得到了两个包含完整开放阅读框(ORF) 以及3′端非编码区( 3′UTR) 的乙烯受体编码基因, 即ZjETR1和ZjERS1。它们分别编码738个和632个氨基酸。这两个编码基因的氨基酸与其它植物乙烯受体氨基酸高度同源, 分别属于ETR1亚类和ERS1亚类乙烯受体。     

草菇gpd基因的克隆、序列分析和其启动子的推测以及冷诱导对其表达方式的影响

草菇3-磷酸-甘油酯脱氢酶（GPD）基因全长1489bp,含有9个内含子。gpd全长cDNA含有1157核苷酸,包含1个编码337个氨基酸的1011 bp开放阅读框和1个95 bp 3’端非翻译区。在1220 bp的5’端侧翼区内检测到启动子元件,该元件含有2个TATA框和3个CAAT框,分别位于开始密码子ATG上游第80、559、333、340和406 bp位点。Southern杂交分析表明,草菇基因组含有1个拷贝的gpd基因。Northern杂交分析表明,gpd基因的表达不受冷胁迫诱导。     

‘金煌’杧果MiCAB2的克隆及表达与花期调控关系分析

以‘金煌’杧果(Mangifera indica L.‘Jinhuang’)为试材,通过RACE及PCR技术克隆得到叶绿素a/b结合蛋白CAB基因的cDNA全长,命名为MiCAB2(GenBank登录号:KT944730)。该基因全长为990 bp,含795 bp开放阅读框,编码246个氨基酸,与橄榄(Canarium album)亲缘关系最近。MiCAB2属于叶绿素a/b结合蛋白家族,其氨基酸序列中存在一个典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域、3个蛋白激酶C磷酸化位点和4个N–肉豆蔻酰位点。实时荧光定量PCR检测表明:MiCAB2在杧果各组织中均表达且表达量差异较大,在成熟叶片中表达量最高,在花、胚胎、果实中表达量仅为叶片的1/50~1/12,在根和茎中极低;在花芽分化至开花期表达量呈迅速上升后下降再上升趋势,在正常胚胎中呈下降后回升再下降趋势,而在败育胚胎中呈逐渐下降趋势;叶片在昼夜交替中,白天表达量明显高于夜晚,14时最高,22时最低。MiCAB2受不同催花药剂的诱导,乙烯利作用最为明显,硝酸钾次之,两者均为正向调控,而多效唑起负调控作用。     

杨梅果糖激酶基因MrFRK2的克隆及在成熟期果实中的表达分析

以‘荸荠’和‘东魁’杨梅果实为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆得到果糖激酶基因MrF RK2的全长c DNA序列。MrF RK2全长1 279 bp,ORF阅读框全长996 bp,3′端非编码区227bp,5′端非编码区56 bp,编码332个氨基酸残基。通过氨基酸序列分析发现Mr FRK2含有pfk B碳水化合物磷酸果糖激酶家族高度保守的1个ATP结合域和2个底物结合域;Mr FRK2与杨树Pt FRK2相似性最高,达到85%。利用实时荧光定量PCR技术分析基因表达的结果表明,Mr FRK2在‘东魁’杨梅果实的发育早期大量表达,在成熟后期表达量下降,果实成熟初期Mr FPK2表达量‘东魁’显著高于‘荸荠’。果实成熟期间果糖含量‘东魁’显著高于‘荸荠’,与果实成熟期间Mr FPK2的表达量相反。这表明,MrF PK2在杨梅果实成熟期间果糖降解过程中可能起一定作用。     

菠萝生长素极性运输载体基因AcPINs和AcAUXs的分离与表达分析

乙烯已经被广泛应用于菠萝人工催花,但其分子机制不是很清楚。以菠萝(Ananas comosus L.‘Perola’)茎尖为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到3个生长素极性运输输出载体基因(Ac PIN1、Ac PIN2和Ac PIN3)和2个生长素极性运输输入载体基因(Ac AUX1和Ac AUX2)的c DNA及基因组DNA全长。Ac PIN1、Ac PIN2、Ac PIN3、Ac AUX1和Ac AUX2的c DNA全长分别为2 690、2 388、2 057、2 156和1 580 bp,其开放读码框长度分别为1 854、1 917、1 530、1 479和1 392 bp,分别编码617、638、509、492和463个氨基酸;其基因组DNA全长分别为3 602、3 208、4 204、5 457和2 436 bp,从起始密码子到终止密码子的长度分别为3 244、2 780、3 947、5 264和2 321 bp。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示Ac PINs和Ac AUXs分别属于植物PINs和AUX/LAXs家族。荧光定量PCR结果表明,菠萝茎尖经200和1 200 mg·L-1乙烯利诱导处理后,Ac PINs的表达上调较多,其中Ac PIN2在处理后的早期(1~2 d)和后期(28~37 d)显著上调,另外两个PIN家族基因Ac PIN1和Ac PIN3在处理后的大部分时间都明显提高。Ac AUX1的上调表达量相对较少,且相对表达量显著提高也主要集中在处理初期(1 d)和后期(28~37 d),而Ac AUX2的上调表达则只在处理后的前期(1、2、9 d)。研究结果表明,乙烯利诱导菠萝成花过程中,存在着生长素极性运输,且生长素极性输出在此过程中的作用可能更重要。     

温度和GA_3对桃果实采后乙烯合成及桃ETR1同源基因表达的影响

为明确桃果实采后成熟衰老期间乙烯的合成与桃ETR1同源基因之间的关系,进一步了解乙烯的转导和作用过程,设计合成了桃ETR1扩增引物RTetr1和RTetr2,用RT-PCR方法研究了温度和GA3处理对白凤桃(Amyg-daluspersicaL.)果实采后乙烯生成和桃ETR1同源基因表达的影响。结果表明,低温处理降低了果实乙烯释放量,低温+GA3处理不仅降低了果实乙烯释放量,还延缓乙烯释放高峰期。PCR分析表明,桃ETR1的cDNA合成受温度和GA3调节,随着乙烯合成能力的增强,ETR1同源基因的表达水平增加,在乙烯信号转导过程中呈正向表达模式。     

杧果MiCO基因的克隆与表达模式分析

【目的】克隆杧果(Mangifera indica L.)MiCO基因并探讨其表达模式,为深入研究该基因的功能奠定基础。【方法】根据从杧果转录组测序数据中获得一个MiCO基因全长序列信息,设计基因全长引物,克隆具有不同开花习性的‘四季杧’和‘紫花杧’2个品种的MiCO基因全长序列,对其序列进行生物信息学分析,并利用荧光定量PCR技术对MiCO基因在杧果不同组织以及年周期的表达情况进行分析。【结果】序列分析显示,2个杧果品种的MiCO基因c DNA全长均为1 150 bp,都包含1个966 bp的开放阅读框,编码322个氨基酸,等电点为5.8,‘四季杧’品种的MiCO蛋白分子质量为35.30 ku,‘紫花杧’品种的MiCO蛋白分子质量为35.22 ku;MiCO基因编码的蛋白具有典型的CO同源蛋白结构,包括B-box1、B-box2和CCT结构域;系统进化树表明,杧果MiCO蛋白属于第一类CO蛋白,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)At COL4相似性最高而聚类到一起。基因表达分析表明,MiCO基因在杧果不同组织中均表达,但不同组织的表达水平存在差异。年周期表达分析表明,MiCO基因在杧果成花转变期高度表达,而且在来年的5—6月还存在一个小的表达高峰期,但2个品种不同组织中MiCO基因表达存在差异。【结论】克隆获得杧果MiCO基因全长序列,发现2个具有不同开花习性的杧果品种的MiCO基因核苷酸和氨基酸序列高度同源,只存在少许差异。MiCO基因在杧果成花转变期高度表达,说明MiCO基因与杧果成花关系密切。     

光皮桦BBX类基因BlCOL13的克隆与表达分析

利用RACE、RT-PCR以及基因组步移技术克隆得到光皮桦BlCOL13全长cDNA（GenBank登录号：KP663425）、全长DNA及其启动子序列。该基因DNA全长2 808 bp,具有4个外显子,3个内含子;cDNA全长1 370 bp,包含1 140 bp的开放阅读框,编码含379个氨基酸的蛋白。BlCOL13蛋白N、C端分别有两个B-box和一个CCT结构域,属于典型的BBX蛋白。以拟南芥中BBX蛋白的分类为参照,通过聚类分析表明BlCOL13属于Ⅱ型BBX蛋白;克隆得到的BlCOL13启动子序列长685 bp,含有多个与成花、光响应、激素信号转导以及逆境胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位试验结果表明该基因主要在细胞核中表达。不同组织中该基因都有一定程度的表达,但在雄花中表达量最高。低温、干旱、ABA和盐胁迫等非生物逆境都在一定程度上诱导BlCOL13的表达,盐胁迫的影响最为明显,表明该基因在光皮桦逆境响应中可能发挥比较重要的作用。     

杧果Rab蛋白基因MiRab11的克隆及表达分析

根据前期对杧果（Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的Rab11 片段,采用RT-PCR结合RACE 技术,从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个Rab11 完整编码区序列,命名为MiRab11。其cDNA 全长902 bp,包含完整开放阅读框657 bp,编码218 个氨基酸。同源性分析表明MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为97%）。实时荧光定量检测结果表明：MiRab11在杧果叶、茎、花和果实中均有表达,在嫩茎和花后70 d 的成熟果实中的表达较高;在果实形成及发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中表达量明显上调;逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起在叶或茎中上调表达;不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果表明,MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。     

狗蔷薇生长素输出载体蛋白基因PIN1 和PIN2的分离与表达分析

 植物体内生长素输出载体PIN 蛋白基因的表达变化间接反映了生长素的运输与积累状态。 为分析生长素在狗蔷薇（Rosa canina）类原球茎发生初期的作用，以狗蔷薇叶片愈伤形成的不定根为材 料，分离了生长素输出载体蛋白基因PIN1 和PIN2 的cDNA，分别命名为RcPIN1（GenBank 登录号 KF543362）和RcPIN2（GenBank 登录号KF543363）。RcPIN1 全长2 266 bp，编码621 个氨基酸；RcPIN2 全长2 248 bp，编码643 个氨基酸，两者推导蛋白结构差异微小，在N 端和C 端均有5 个跨膜区域，中 间1 个亲水区。Blast 比对发现两个基因与多种植物PIN 基因具有高度同源性（> 70%）。半定量RT-PCR 分析表明，RcPIN1 在根、茎中表达量高于叶和花，RcPIN2 在根中表达水平高于茎、叶和花；在狗蔷薇类 原球茎发生初期，TDZ 诱导培养下愈伤—不定根RcPIN1 和RcPIN2 表达上调，而TDZ + TIBA 抑制培养 下两基因表达不活跃，且类原球茎形成率降低。试验结果表明生长素的极性运输与积累参与了调控狗蔷 薇类原球茎的初期形态建成。     

杧果低分子量热激蛋白基因MiHSP17.6的克隆及表达分析

采用RT-PCR与RACE相结合的方法获得了杧果低分子量热激蛋白基因的cDNA全长序列,命名为MiHSP17.6,GenBank登录号为KJ459857。序列分析显示,该基因序列全长为680 bp,其中开放阅读框为462 bp,编码154个氨基酸,5′非编码区和3′非编码区长度分别为80 bp和135 bp。杧果MiHSP17.6与其他物种的低分子量热激蛋白同源性介于74% ~ 82%。实时荧光定量分析表明,MiHSP17.6在‘四季杧’不同组织器官中均表达,在果实发育的中期表达水平持续上升。高温（44 ℃）、低温（4 ℃）、盐（NaCl）、聚乙二醇（PEG）、脱落酸（ABA）、双氧水（H2O2）和水杨酸（SA）处理均诱导该基因表达,因此推测MiHSP17.6的功能可能与杧果果实发育和抵御逆境胁迫相关。     

津田芜菁BrEGL3 cDNA的克隆及表达分析

 EGL3（Enhancer of Glabra3）蛋白是一种bHLH类蛋白,是一类重要的转录调节因子。为阐释BrEGL3在‘津田’芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapifera‘Tsuda’）花青素生物合成中的调控作用,根据拟南芥EGL3基因序列信息设计兼并引物,克隆获得了‘津田’芜菁EGL3基因的全长cDNA序列,命名为BrEGL3,其GenBank登录号为HM208589。序列分析结果显示,BrEGL3全长1 794 bp,包含编码597个氨基酸的开放阅读框,分子量约为66.8 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白含有DNA结合域,该结合属于螺旋—环—螺旋家族。氨基酸对比分析表明,BrEGL3与萝卜EGL3蛋白相似性最高,其次为拟南芥中的EGL3。荧光定量PCR检测BrEGL3在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合成的红色芜菁根皮中表达量最高。     

香蕉茉莉酸合成关键酶基因MaOPR 的克隆和表达分析

 从‘巴西’香蕉（Musa acuminata L. AAA group‘Brazilian’）根的cDNA 文库中获得了一段 12–氧–植物二烯酸还原酶OPR（12-oxo-phytodienoic acid reductase）基因的片段,RACE 扩增获得全长, 命名为MaOPR。该基因全长1 512 bp,存在一个完整的开放阅读框1 287 bp,编码429 个氨基酸。生物 信息学分析表明,该蛋白属稳定蛋白,等电点为8.11,具有一个活性位点,一个基质结合位点,一个黄素 单核苷酸结合位点。序列预测分析该蛋白亚细胞定位为细胞质,其不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。通 过和已知植物的12–氧–植物二烯酸还原酶基因相比,同源性达到66%以上。其中与苜蓿、谷子、粳稻、 紫云英的OPR 编码的氨基酸序列的同源性均为71%。器官特异性分析表明,MaOPR 在香蕉的根、茎、 叶片、花和果实中均有所表达,其中在茎和果实中表达量较高。通过对其在ABA 抑制剂、乙烯、枯萎病 胁迫下的表达结果分析显示,该基因响应以上3 种胁迫。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

一氧化氮参与乙烯诱导黄瓜不定根的形成

以黄瓜(Cucumis sativus L.)切去初生根的幼苗外植体为试材,研究了乙烯和一氧化氮(NO)对其不定根形成的影响及其相互关系。结果表明,外源乙烯供体乙烯利(Ethrel)可显著促进黄瓜外植体不定根的形成,呈现明显的剂量效应,最适浓度为0.5μmol·L~(-1)。Ethrel和NO共同处理的外植体不定根的数量和根长显著高于Ethrel和NO单独处理,但Ethrel的促进作用可被NO的清除剂c-PTIO、一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME和硝酸还原酶(NR)抑制剂NaN_3所逆转,说明乙烯和NO在黄瓜外植体不定根形成过程中具有协同诱导作用。外源乙烯引起黄瓜外植体内源NO含量的增加,亦提高了植株体内合成NO的NOS和NR酶的活性以及NOS和NR基因的相对表达量。可见,NO在乙烯诱导黄瓜不定根形成的信号途径中起重要作用。     

牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析

根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERK2的部分cDNA片段,采用RACE技术扩增到5′和3′ cDNA片段,通过拼接得到PsSERK2基因2 374 bp的全长cDNA序列,其中5′非编码区（UTR）为158 bp,3′UTR为341 bp,ORF为1 875 bp,编码625个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄VvSERK2蛋白同源性最高,为92.95%。PsSERK2在初花期（大风铃期）茎中表达量最高,叶片中最低。Northern杂交和定量PCR结果均表明PsSERK2在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达,而后降低。低温累积过程中,花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测PsSERK2上调表达促进了休眠花芽的发育,进而促进内休眠的解除。     

结球甘蓝花粉蛋白延伸因子基因的克隆及其序列分析

 以结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）E1花粉为试材,对萌发前后的花粉总蛋白进行双向电泳及差异蛋白质谱分析,发现延伸因子BoEF-Tu蛋白在花粉萌发后较萌发前表达上调。利用同源克隆得到甘蓝BoEF-Tu基因的全长cDNA序列,其长度为1 728 bp,具有一个完整开放阅读框（ORF）,位于112 ~ 1 473 bp处,编码453个氨基酸残基,预测分子量为49.17 kD,等电点为6.52。生物信息学分析表明：BoEF-Tu蛋白含有9个α–螺旋结构,18个β–折叠结构,不含信号肽和跨膜区,在106 ~ 121位氨基酸残基处有1个GTP结合区域（DKAPEEKKRGITIATA）。氨基酸同源性分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-TuM同源性较高,达到93%;系统进化分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-Tu的亲缘关系最近。