甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物, 采用RT-PCR方法从甜瓜花后25 d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段, 克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明, 该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9% , GenBank中登记号为DQ355797。通过Northern blot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化, 结果表明该基因在甜瓜果实花后25 d开始表达,随着果实的成熟, 表达量升高。     

甜瓜果实酸性转化酶基因反义表达载体的构建(英文)

应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

At2基因双T-DNA植物表达载体的构建

以甜瓜品种‘MR-1’为试材,采用PCR技术,扩增出了At2基因并在两端添加BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。结果表明:在NCBI上进行BLAST显示其氨基酸序列与GeneBank中已公布的At2基因的同源性为99%;经DNAMAN软件分析,核苷酸序列同源性为99.43%。将其连接在中间表达载体G-pPTN133上,得到替换了GUS基因的中间载体A-pPTN133。A-pPTN133再经ScaⅠ酶切后,插入到经ScaⅠ酶切的pPTN133~-中,构建成双T-DNA植物表达载体At2-pPTN133。经酶切和PCR鉴定证明了所构建载体的正确性。     

杨梅酸性转化酶基因cDNA分离及表达分析

杨梅果实富含蔗糖,酸性转化酶是蔗糖代谢关键酶,根据植物酸性转化酶基因保守区序列设计引物,提取杨梅叶片RNA,逆转录获得cDNA,以此为模板通过PCR技术扩增到长度为516bp的基因片段,克隆入pMD18-T载体中,命名为MrIVR1(GenBank:DQ339699)。测序及同源性检索表明,该基因推导氨基酸序列与君子兰、葡萄、草莓、胡萝卜等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为60%～69%。运用ClustalX软件对植物转化酶基因进行了系统树分析,结果显示,MrIVR1编码的蛋白质属于细胞壁酸性转化酶。半定量RT-PCR表达分析显示,MrIVR1基因在杨梅果实发育早期表达量最高,随着果实的发育表达量下降,在成熟果实中表达水平较低。     

柿果ACC合成酶基因的克隆与植物表达载体的构建

以柿果组织中分离的总RNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.1 kb的富有柿果ACC合成酶(Fuyu-ACS)的 基因片段,将此片段克隆到pGEMR-T easy vector上,经测序分析与Genbank中平核无柿果的DK-ACS1基因核苷酸 序列的同源性为99％。设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ACS- Fuyu片段。2个片段经双酶切消化后,分别以正反2个方向插入到植物表达载体pBI121的35 S启动子和NOS终止 子之间,构建成Fuyu-ACS基因的植物表达载体。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

八氢番茄红素合成酶(PSY2)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aPG上切下大小约2.3kb的目的基因,将它定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体pCB-aPG。采用直接转化法将pCB-aPG导入根癌农杆菌菌株LBA4404,采用该菌株对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中。此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。     

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因植物表达载体的构建

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)是危害中国葫芦科作物主要病毒之一。试验以该病毒中国分离物外壳蛋白基因的克隆载体pZCP-87(含ZYMV的CP基因)为材料,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切,从胶上回收目的基因,与经过同两种酶酶切的植物表达载体pBIN438连接,转化感受态的大肠杆菌细胞,提取质粒,经PCR和SalⅠ/BamHⅠ双酶切验证,已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上(重组质粒命名为pBZCP5),采用冻融法完成了对pBZCP5质粒的农杆菌转化。该工作是通过转基因获得抗ZYMV病毒研究的基础。     

月季（Rosa chinensis）丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及其表达分析

 根据GenBank 发表的丁香酚合成酶（EGS）基因的蛋白保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR 技术,从古老月季（Rosa chinensis）品种‘月月粉’盛开期的花瓣中获得了1 个新的丁香酚合成酶基因RcEGS1,GenBank 登录号为JQ522949。该基因全长为1 171 bp,开放阅读框（ORF）951bp,编码317 个氨基酸;蛋白质理论分子量为35.64 kD,等电点为7.36。氨基酸同源性分析表明,RcEGS1与矮牵牛PhIGS1 的氨基酸同源性达到70%,与罗勒ObEGS1 的同源性为59%,与月季RhEGS1 的同源性仅为48.2%。运用实时荧光定量PCR 法分析RcEGS1 在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达,发现其在叶片和茎段中没有表达,在花瓣和萼片中有表达,在盛开期的花瓣中表达量最高。     

甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因CmGAS1的表达与功能分析

甜瓜（Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖（Raffinose Family Oligosaccharides,RFOs）转运型植物。肌醇半乳糖苷合成酶（GAS）是催化RFOs合成的关键酶。甜瓜CmGAS1基因（GenBank登录号为AY077642.1）的cDNA全长为1 903 bp,开放阅读框（ORF）为996 bp,编码331个氨基酸。CmGAS1蛋白分子量约为38 kD,理论等电点（pI）为4.81。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmGAS1氨基酸序列与黄瓜（AAO84915.1）亲缘关系最近,同源性为98.79%,与西瓜（Cla009222）同源性为97.58%。荧光定量结果表明,甜瓜叶片从幼叶（库）至成熟叶（源）CmGAS1的表达显著升高,第5节位叶片达到最大值。去掉50%叶片植株与对照相比,完全展开功能叶片的CmGAS1表达量明显升高。应用CmGAS1特异性启动子构建CmGAS1的过表达载体,并采用农杆菌介导进行甜瓜遗传转化,获得了PCR阳性转化植株,转化植株完全展开功能叶片的净光合速率以及叶片中的蔗糖、棉子糖、水苏糖含量与野生型相比均有所提高。推测CmGAS1在甜瓜叶片棉子糖系列寡糖合成过程中起重要作用。     

甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。     

甜瓜果实酸性转化酶基因cDNA片段的克隆

 根据在GenBank中登录的番茄、胡萝卜和柑桔等酸性转化酶基因的保守序列设计引物，采用RT-PCR方法，从甜瓜果实总RNA中扩增出目标cDNA片段，克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明，它与其它植物的酸性转化酶基因的同源性很高，与番茄氨基酸序列同源性为99％，说明已经成功克隆到甜瓜果实酸性转化酶基因cDNA片段，在GenBank中登记号AF490425。     

月季CBF 转录因子基因的克隆及表达分析

 根据CBF（C-repeat binding factor）AP2/EREBP 保守区设计1 对简并引物,采用PCR 方法对月季‘寒锦4 号’（Rosa hybrida‘Hanjin 4’）CBF 转录因子基因中间片段进行克隆;再根据中间片段区域设计了两对特异引物,采用反向PCR 方法对该基因的5'和3'端的序列进行克隆,将中间片段与反向PCR 产物拼接得到CBF 基因全长序列,命名为RhCBF,GenBank 注册编号为EF582843;该基因序列长758 bp,ORF 为603 bp,编码200 个氨基酸;同时,根据基因序列设计1 对特异引物,利用荧光定量PCR分析月季CBF 在不同逆境胁迫下的表达情况。结果显示低温和盐均可以诱导RhCBF 的表达,而干旱处理不能诱导其表达。     

番茄酸性转化酶cDNA片段的克隆与表达分析

 根据番茄细胞壁束缚性和可溶性酸性转化酶基因序列分别设计引物, 以普通栽培型番茄(Lycopersicon esculentum ) ‘辽园多丽’和‘桃太郎’及野生番茄(Lycopersicon chmielewskii) 的幼苗为材料提取总RNA, 采用RT2PCR方法, 扩增出目的cDNA序列的部分片段并克隆到pMD18-T载体中。经测序后发现不同基因型番茄的酸性转化酶基因具有高度同源性, 达到99.5%。进一步检测其在‘辽园多丽’果实发育不同时期的表达变化, 结果表明主要在成熟果实的胶质胎座中大量表达, 而在果实的其它部位几乎检测不到其表达。     

甜瓜抗旱性相关基因MeP5CS的克隆、序列分析及表达

用GenBank登录的抗旱相关基因序列进行比对,在保守区域设计一对引物,利用RT-PCR获得了一个甜瓜抗旱相关基因,命名为MeP5CS。生物信息学分析表明,该基因全长1000bp,开放阅读框(ORF)753bp,编码250个氨基酸;MeP5CS蛋白大小约82.18kD,理论pI值为4.90;MeP5CS编码蛋白与桐花树、猕猴桃和葡萄同源性较高,分别为94%、81%和73%。该蛋白含约40.2%的α-螺旋,25.2%的β-转角,34.6%的不规则卷曲,在第19～20氨基酸之间存在信号肽的剪切位点;MeP5CS编码蛋白是疏水性蛋白,有2个跨膜螺旋结构和13个磷酸化位点。半定量RT-PCR表明,MeP5CS在甜瓜根系中表达最高,茎中次之,叶片中表达较低。MeP5CS基因在甜瓜组织中的表达受丛枝菌根真菌(AMF)和水分胁迫双重诱导,与甜瓜的组织特异性和水分胁迫处理时间有关。水分胁迫条件下,接种AMF可以显著增加甜瓜幼苗脯氨酸的积累量,菌根甜瓜幼苗的脯氨酸积累与MeP5CS基因的表达呈正相关。