高产中性纤维素酶的巨大芽胞杆菌基因工程菌发酵工艺条件优化

为了加快纤维素酶工业化应用的步伐,解决纤维素酶发酵工业产量低、生产成本高等问题,本研究采用正交设计法对高产中性纤维素酶的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)基因工程菌的培养基和发酵条件进行优化.结果表明,最佳发酵培养基成分为:麦麸2.5%、玉米浆1.5%、磷酸二氢钾0.75%、硫酸镁0.04%、氯化钠0.25%;最佳发酵条件为:温度37℃,pH 7.0,罐压0.03～0.05 Mpa,转速600 r/min,装液量3 L,接种量10%,培养4 h后以0.25 g/L/h的流速流加木糖10 h,发酵16 h后,以恒溶氧方式流加补料8 h,共补加料320mL,发酵过程控制溶氧浓度≥30%.该工程菌在此最佳发酵条件下培养,纤维素酶活力可达3846.48 U/mL,是优化前摇瓶发酵的4.3倍.本研究可为工业化生产纤维素酶提供依据.     

侧胞芽孢杆菌发酵工艺的研究

侧胞芽孢杆菌是应用于微生物肥料的一种重要功能菌,采用正交试验筛选了侧胞芽孢杆菌的发酵培养基配方,并探讨了发酵工艺条件。结果表明,侧胞芽孢杆菌的摇瓶发酵最佳培养基为蔗糖3.0%、酵母膏0.8%、蛋白胨1.2%、MgSO40.075%、KH2PO40.25%、MnSO40.010%、CaCO30.8%最佳;培养条件为温度32.5℃、转速200 r/min、接种量2%以上、pH为7.6,发酵液中的所得菌浓度可达9×108个/mL。     

基因工程菌诱导表达苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的条件优化

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,Vip)是在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)营养生长至对数中期到稳定期期间产生的一类蛋白。为获得苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的高效表达条件,本研究利用正交试验综合考察了大肠杆菌(Escherichia coli)重组基因工程菌BL21-p Czn1-Vip诱导过程中诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对Vip3Aa蛋白表达量的影响。结果表明,该工程菌目的蛋白的最优诱导表达条件:诱导温度21℃、诱导时间8 h、诱导剂(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dthiogalactoside,IPTG))浓度为200μg/m L;直观分析表明,影响目的蛋白表达量的最主要因素为诱导温度,其次为诱导时间,诱导剂浓度影响最小;方差分析结果表明,诱导温度的P值0.01、诱导时间的P值0.05、诱导剂浓度的P值0.05,与直观分析结果相一致;利用优化后诱导表达条件进行培养,测得目的蛋白最高表达量可占总蛋白的27.6%,相当于常规诱导方法的2.3倍。本研究为大量制备高纯度Vip3Aa蛋白及其深入的理论研究和实践应用提供了基础资料。     

苏云金芽胞杆菌类ABC transporter基因zwa-FEG能提高双效菌素的抗性

双效菌素(zwittermicin A,ZwA)是一种氨基多元醇类新型广谱抗生素,zmaR为其抗性基因。在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520菌株ZwA合成基因簇末端存在一个类似ABC transporter的序列(命名为zwa-FEG)。将zwa-FEG基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,大肠杆菌能获得ZwA的抗性;将zwa-FEG转移到产ZwA的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株UW85中,能使其ZwA产量显著提高。推测zwa-FEG是一种ZwA专一性的ABC transporter,它能将ZwA分泌到胞外,从而增强ZwA的合成和ZwA的抗性。     

人工神经网络方法在红曲杨梅果酒发酵工艺优化中的应用

将人工神经网络技术与传统正交试验方法相结合，提出一种新的试验数据分析和处理方法，利用神经网络特有的自学习能力，可以充分挖掘正交试验数据信息，并通过仿真、评估和优化，获得了红曲杨梅果酒发酵的最佳工艺：发酵温度18℃、糖汁比4∶6、酵母加量15%、红曲加量2.1%。将该优化工艺应用于实际生产中，取得了较好的效果。     

多指标综合加权分析法优化固态发酵豆粕工艺

运用正交设计L9(34)与多指标综合加权分析方法优化3种益生复合菌发酵豆粕的工艺,采用接种量(A)、环境温度(B)、料水比(C)、发酵菌种(D)为处理因素,以还原糖、乳酸、氨基酸含量等作为综合评价指标,利用Minitab 17软件以及多指标试验公式法进行加权数据处理,优化豆粕的固体发酵工艺参数。结果显示,1)经过加权分析,中性蛋白酶权重系数最高,其次为还原糖(1.719)和乳酸(1.590),粗脂肪权重系数最低。说明本试验中性蛋白酶、还原糖以及乳酸对发酵豆粕的品质影响较大。2)通过综合评分公式对9个处理组数据分析得到:T9组综合评分最高(0.986 3),T1组(0.965 4)和T8组(0.962 6)次之,表明在T9组合(A3B3C2D1)条件下发酵豆粕,所选8项考察指标综合水平达到最高。因此拟选T9组合为最佳发酵工艺组合;3)均值回应表显示影响豆粕发酵工艺的因素依次为:发酵菌种料水比环境温度接种量,其中发酵菌种和料水比为显著影响因素(P0.05),而接种量和环境温度对试验结果影响不显著。从资源节约以及生产实际角度考虑,将T9组发酵工艺A3B3C2D1优化为A_1B_2C_2D_1,即接种质量分数1%,环境温度30℃,料水比质量为2∶1,发酵菌种配比为1∶1∶1。4)Minitab17软件对优选工艺A_1B_2C_2D_1进行预测,结果显示优选工艺综合评分高于拟选工艺A3B3C2D1综合评分(0.986 3)。验证试验得出各指标产出与预期结果相符,表明该优化工艺合理、可行,各指标产出率较高,为豆粕发酵工艺的确定提供了参考依据。     

芽胞杆菌高产纤维素酶菌株的诱变选育与培养基优化

为获得高产纤维素酶菌株,采用紫外(UV)诱变和紫外-亚硝基胍(UV-NTG)复合诱变方法对新疆吐鲁番地区土壤中分离得到的产纤维素酶菌株芽胞杆菌C-8进行诱变筛选,并通过二次正交旋转组合试验和响应面试验对诱变筛选得到的菌株进行培养基的优化。结果表明,UV诱变菌株UV-5和UV-NTG比出发菌株C-8纤维素酶活分别提高了1.15倍和3.23倍;当发酵培养基中碳源浓度为3%、氮源浓度为1.5%、吐温-80的浓度为0.15%时,纤维素酶活达到453.20 U·m L-1,是出发菌株C-8的5.49倍和复合诱变菌株UV-NTG-10的1.7倍。本研究结果为纤维素酶的扩大发酵以及后期工业化生产提供了理论依据。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ脱脂乳的发酵工艺优化

为研发富含植物乳杆菌ST-Ⅲ新型益生菌发酵乳制品,该试验尝试用植物乳杆菌ST-Ⅲ和嗜热链球菌共发酵,并对植物乳杆菌ST-Ⅲ发酵乳的工艺进行了优化研究。通过单因素试验分析了大豆多肽添加量、葡萄糖酸锰添加量、嗜热链球菌的接种量和发酵温度对发酵乳的pH值和植物乳杆菌ST-Ⅲ活菌数的影响。通过响应面法优化并确定了最佳工艺条件:大豆多肽添加质量分数11 g/kg;葡萄糖酸锰添加质量分数11 mg/kg;嗜热链球菌的接种量106 CFU/g;植物乳杆菌ST-Ⅲ的接种量106 CFU/g;发酵温度为37℃。在此优化最佳工艺条件下,发酵乳的植物乳杆菌ST-Ⅲ的活菌数为1.88×109 CFU/mL,有效地提高了发酵乳中植物乳杆菌ST-Ⅲ的活菌数。研究结果可为拓展植物乳杆菌ST-Ⅲ在乳制品领域的应用提供参考。     

甘薯渣同步糖化发酵生产酒精的工艺优化

为了综合利用甘薯淀粉工业废渣,本研究以甘薯渣为原料发酵生产酒精,并对其同步糖化发酵工艺(SSF)进行优化。研究同步糖化发酵时影响酒精发酵工艺的9个因素,采用Plackett-Burman试验设计筛选出显著因素,并在筛选结果的基础上,用最陡爬坡途径逼近最大响应区域,然后利用响应面分析法确定其最佳参数。结果表明,影响酒精发酵工艺的显著因素为糖化酶、接种量和发酵温度。酒精发酵优化最佳参数为:α-淀粉酶8U/g,液化时间1.5h,液化温度90℃,硫酸铵质量分数0.15g/100g,pH值4,发酵时间36h,糖化酶151U/g,接种量0.3%,发酵温度36℃。在此条件下,验证试验得到的酒精体积分数达到17.15%,接近理论预测值16.95%。优化后的工艺可为甘薯渣同步糖化发酵生产酒精提供技术参考。     

糙皮侧耳产洛伐他汀发酵培养基的优化

为提高糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)液体发酵产洛伐他汀的产量,以高产洛伐他汀的糙皮侧耳菌株P380为研究对象,在单因素试验的基础上采用正交试验优化发酵培养基组成。优化后的培养基为:乳糖24.0 g·L^-1,玉米粉2.5 g·L^-1,氯化铵2.5 g·L^-1,磷酸二氢钾5.0 g·L^-1,硫酸镁2.5 g·L^-1,初始pH值6.0。通过优化培养基,可显著提高糙皮侧耳发酵培养基中洛伐他汀产量,与原始发酵培养基相比,洛伐他汀产量提高3.15倍,生物量提高1.78倍。本研究结果为糙皮侧耳发酵菌质的合理开发利用奠定了基础。     

纳豆菌液态发酵蛤蜊制备ACE抑制肽的工艺研究

为了开发海洋水产源降血压多肽,以蛤蜊为原料,利用纳豆菌液态发酵法制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,并以ACE抑制率和总肽含量为控制指标,在单因素试验基础上,采用五因素三水平正交试验优化发酵工艺。结果表明,最佳发酵条件为:发酵温度45℃,发酵时间24h,接种量5%,料液比1∶25,蔗糖添加量10%。在此发酵条件下,发酵产物对ACE抑制率达80.49%,总肽含量达11.53mg·m L-1。本研究结果为蛤蜊的高值化利用提供了科学依据。     

珍稀食用菌绣球菌液体发酵工艺条件优化

为研究绣球菌最适的液体发酵条件,同时保证其多糖的产量,以绣球菌菌丝干重和胞外多糖(EPS)产量为评价指标,采用单因素和正交试验L9(34)优化绣球菌液体发酵工艺。结果表明,最佳液体发酵工艺条件为:碳源为葡萄糖,氮源为蛋白胨,无机盐为硫酸镁,pH值5.5,C/N=20/1,培养温度27℃,此工艺条件下菌丝干重和EPS产量最高,分别为1.5 g·L~(-1)和2.87 mg·L~(-1)。本研究结果为绣球菌后续的相关研究提供了理论依据。     

重组球孢白僵菌表达目标产物类枯草杆菌蛋白酶的发酵特性研究

采用单因子筛选和正交试验,研究了碳源、氮源、微量元素及无机盐等营养成分对重组球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Bb0062-15-4-CDEP-1产生目标产物类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的影响,并通过摇瓶发酵和30 L发酵罐发酵对其发酵特性进行了研究.结果表明,其优化发酵培养基为2.0%玉米粉,1.0%麦麸,0.25%豆粕粉,0.4%NaNO3,0.1%MgSO4·7H2O.摇瓶发酵结果表明,在对数生长期,随着菌体生物量的增加,CDEP-1产量上升,二者呈一定的平行关系;当菌体生长到稳定期,CDEP-1产量继续上升,并达到产酶高峰;此后,随着菌体生长的衰退,CDEP-1产量出现快速下降趋势.扩大培养时,30 L发酵罐中60 h产酶量最高,比摇瓶培养(168 h)缩短了108 h,单位体积的产酶量比摇瓶培养提高80%.结果对研究和利用该球孢白僵菌重组菌株的代谢产物,提高真菌杀虫剂的杀虫效果奠定了基础.     

质粒pcDNKLYZ在发酵过程中的稳定性

在发酵过程中,使用质粒pcDNKLYZ为参照,分别以批次发酵和补料发酵来控制细菌的生长速度,结果表明,质粒菌pcDNKLYZ经20次连续传代,其结构和产量没有发生改变;发酵过程中的宿主细胞增殖速度与质粒的复制速度基本一致;应用补料发酵时较低的溶氧(30%)和转速(350r/min)即可满足要求,而批次发酵时,则需较高的溶氧(40%)和转速(700r/min);补料发酵细菌的OD600可以达到30,单位湿菌重的质粒产量(500μg/g)比批次发酵的质粒产量(480μg/g)稍多;同时,质粒丢失率从批次发酵时的5.88%下降到补料发酵的0.63%,为质粒的大规模生产提供了可靠依据。     

海洋枯草芽孢杆菌UMBR1027产抑金黄色葡萄球菌活性蛋白分离鉴定及发酵条件优化

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种能引起严重传染性疾病的人兽共患病原菌,由于其严重的致病性及其易产生耐药性的特点,使得探索新的具有活性的药物的需求越发迫切.为了研究对S.autrgus有抑制作用的活性蛋白,本实验采用硫酸铵沉淀法对海洋枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)UMBR1027产抑S.aureus活性蛋白进行提取,并利用葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳进行分离、ABI 4800 plus MALDI-TOF进行鉴定;为了提高活性蛋白在B.subtilis UMBR1027发酵过程中的产量实验采用滤纸片扩散法,以抑菌圈直径为指标,分别从培养基pH、培养基的盐度以及培养温度这3个关键因素对B.subtilis UMBR1027产抑S.aureus活性蛋白的影响进行考察,并设计Box-Behnken实验以优化其发酵条件.结果显示活性蛋白主要含有碱性丝氨酸蛋白酶、α-淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶和内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶,优化实验得出B.subtilis UMBR1027产活性蛋白的最佳发酵条件组合为培养基pH为6.95、培养基盐度为10.38％、发酵培养温度为34.95℃;拟合实验中选取发酵培养基pH为6.95,发酵培养基盐度为10.38％,发酵温度为35℃进行验证,抑菌圈直径为20.4 mm,与理论值基本吻合.本研究对B.subtilis UMBR1027所产抗菌粗蛋白进行了分离,并成功对抗菌粗蛋白分离纯化后的各个部分进行了鉴定.响应曲面法有效提高了B.subtilis UMBR1027产抑制S.aureus的抗菌蛋白类物质,此研究为探索来自海洋的活性抗菌蛋白类天然药物分子提供了理论依据.     

亚麻叶中活性物质提取工艺优化研究

为筛选制定出亚麻叶中五种活性物质的最佳提取工艺,以亚麻叶中提取的荭草素、绿原酸、异荭草素、牡荆素、异牡荆素5种成分的含量作为指标,通过单因素试验研究含醇量、提取时间、固液比、提取次数、提取温度对5种成分提取效果的影响;并利用L9(34)正交试验法方法,优选最佳的提取工艺。确定的最佳提取工艺为乙醇溶液浓度75%、料液比1 ∶ 15(g/mL)、提取次数2次、提取时间1.5 h、温度80 ℃。该提取工艺是一种适合于亚麻叶中有效成分提取的有效方法,可为亚麻叶研究和开发利用提供参考。     

亮菌多糖提取工艺优化及体外抗肿瘤活性研究

本研究进行了亮菌多糖水提、醇沉工艺条件优选并对其体外抗肿瘤活性进行了研究。以多糖含量为指标,设计正交试验考察料液比、浸提温度、浸提时间、浸提次数对亮菌多糖提取工艺的影响;以多糖得率为评价指标,选乙醇浓度、乙醇加入量、醇沉时间为考察因素,通过正交试验优选醇沉工艺;采用MTT法测定多糖对4种肿瘤细胞增殖的抑制作用。结果显示亮菌多糖最佳浸提工艺为料液比1：10,提取次数为2次,浸提温度100℃,时间6 h;最佳醇沉条件为加4倍量95%乙醇沉淀15 h;醇沉后多糖得率11.768%。活性测试结果显示ATPS对人红白血病细胞和人肺癌细胞株的生长具有抑制作用。优选的提取工艺条件稳定,可为ATPS的生产提供实验依据;亮菌多糖对体外肿瘤细胞的生长具有抑制作用。