实时荧光定量PCR在植物病害中的应用

实时荧光定量PCR技术作为一项新兴技术,越来越受到人们的重视。它以快速、准确定量、便捷等优点广泛应用于科学研究各个领域,近年来, 实时荧光定量PCR技术在植物病害研究上不断深入,大大提高了植物病害的检测效率和监测防治水平。本文重点就对实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒、线虫引发的植物病害的检测与应用;并结合了最近几年来应用于检测和鉴定植物病原病害的实时荧光定量PCR过程中引物与探针的设计、反应过程、结果评价情况做综合论述。     

实时定量PCR检测技术研究进展

传统定量PCR检测方法如内参照法和竞争PCR法,因为在达到平台期后才能对其进行检测,由于PCR扩增已经过了对数期,其检测重复性相对较差.而实时荧光定量PCR技术可直接监测PCR过程中荧光信号的变化,以获得目的区段扩增产物定量的结果,直接可以进行定性分析和定量分析,操作简便无污染.本文通过对实时荧光定量PCR检测技术的原理、分类、方法和应用4个方面阐述实时定量PCR检测技术研究进展.     

实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究

以转基因大豆Roundup Ready为材料，通过特异性引物和探针，对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测。研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法，但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度，其检测阈值可降到0.05%，变异系数为0.09%~0.53%。在此基础上，建立和优化了Taqman探针实时荧光定量PCR检测技术体系，有助于提高转基因作物及产品的生物安全性定量检测的准确度和可靠性。     

荧光定量PCR技术在禽病诊断中的应用

为了解荧光定量PCR技术在禽病诊断中的应用情况。查阅近3年荧光定量PCR及其在禽病研究中的相关文献。结果表明,荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,为禽病诊断技术提供了新的模式,成为当前禽病检测广泛采用的分子生物学诊断技术。实时荧光定量PCR技术在禽流感、鸭瘟、鹅细小病毒、鸭疫里默氏杆菌等禽病检测上的应用进行综述,以期为禽病的综合防控提供参考。     

荧光定量PCR技术研究进展及其在植物遗传育种中的应用

荧光定量PCR（Fluorescence in Quantitatire PCR，FQPCR）技术是20世纪90年代发展起来的一种新的核酸定量技术，具有高准确性、高特异性等特点，在生物科学和医学研究中发挥着极大的作用。本文综述了荧光定量PCR技术的原理、荧光探针类型及其在植物遗传育种中应用。     

荧光定量PCR技术在猪病毒病诊断上的应用

摘要：荧光定量PCR技术融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,以直接探测PCR过程中荧光信号的变化获得定量的结果。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,为动物疫病诊断技术提供了新的模式,成为当前动物疫病检测广泛采用的分子生物学诊断技术。论文就实时荧光定量PCR技术在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环、猪流感等猪病毒病检测上的应用作一综述,以期为猪病毒病的防控提供参考。     

实时荧光定量PCR技术研究进展及其在兽医学中的应用

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。随着现代医学和分子生物学的飞速发展,该技术已在兽医学的基础研究及临床应用方面发挥着越来越大的作用。本文将对FQ-PCR技术的原理、检测方法研究进展以及目前的应用状况等作一综述。     

抗旱水稻种子转基因成分检测技术研究

利用组织研磨仪快速处理水稻种子样品,采用高通量的磁珠纯化系统提取样本DNA,提取的核酸通过紫外吸收检测其纯度,应用普通PCR检测方法和实时荧光PCR方法对水稻内源基因SPS、靶基因ATAF1进行检测。结果表明,普通PCR方法和实时荧光PCR方法均表现快速、准确、特异性高的特点。     

反转录实时定量PCR在植物基因表达分析上的研究进展

近年来,反转录实时定量PCR作为一项新的核酸序列定量分析技术以其定量准确、高灵敏度和高通量等特点,已被广泛的应用于分子诊断、病理分析以及食品安全检测等方面。然而其在植物基因表达水平研究上的报道较为少见。本研究在前人研究基础上,总结了反转录实时定量PCR在植物基因综合表达分析、基因家族表达分析、基因差异表达分析、转基因表达分析等方面的应用;分析了反转录、看家基因选择等影响检测基因表达的因素;指出该技术在重复性、灵敏度、标准化上所存在的问题。随着分子生物技术的发展,反转录实时定量PCR将会在植物遗传育种、植物病理检疫以及分子进化等方面发挥更为广泛的作用。     

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)实时荧光定量检测方法的研究

为建立快速准确的检测土壤中辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)的实时荧光定量体系的方法,根据辣椒疫霉菌保守的ITS序列设计的特异性荧光实时定量PCR的引物,通过对保守序列构建克隆文库,筛选阳性克隆子,制备用于实时荧光定量体系的标准品,从而构建优良的标准曲线。利用构建的标准曲线和优化的实时荧光定量体系对人工接种含梯度浓度的辣椒疫霉菌的土壤样品进行实时荧光定量PCR检测。辣椒疫霉菌荧光实时定量PCR检测体系的标准曲线的相关系数为R2=0.980,斜率为-3.295,扩增效率为101.1%,线性方程为Y=-3.295X+44.484,标准品的检测下限为1.000×102拷贝,带菌土壤的检测下限为1.236×103拷贝,约为4.887pg基因组DNA。经过土壤样品试验,得出标准曲线相关系数为0.9845,表明所建立的辣椒疫霉菌实时荧光定量PCR检测方法合理有效。     

多重荧光PCR检测肠出血性大肠杆菌（VTEC）方法的研究

为寻找一种能广泛应用于食品检验、临床诊断的快速、简便、灵敏度高、特异性较好、价格低廉的肠出血性大肠杆菌（VTEC）的检测方法;对VTEC致病相关基因VT1和VT2基因序列进行分析,并设计2对特异引物,通过SYBR GreenⅠ多重荧光PCR反应法结合熔链曲线分析,实现对VTEC的检测;结果表明该方法具有较高的灵敏度及特异性,能够对肠出血性大肠杆菌（VTEC）进行有效检测,其最低检出限可达10cfu/g。利用该技术检测VTEC,具有快速、方便、准确、高效的特点,是一种适于检验检疫和兽医临床检验等领域的快速检测的有效方法。     

PCV2感染猪皮肤源树突状细胞内源性抗原加工提呈相关分子转录水平的变化

用猪圆环病毒2型（PCV2）感染40日龄健康长白仔猪,于感染后3、7、14、21和35天宰杀,收集皮肤源树突状细胞（DC）。利用实时荧光定量PCR技术对感染仔猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈相关分子（LMP7,UBP,MHC-I,calreticulin）mRNA水平的变化进行定量分析。结果显示,LMP7转录水平在感染后3天显著下调（P < 0.05）,UBP转录水平始终上调,其中在21天和35天显著上调（P < 0.05）,MHCⅠ转录水平在7 天显著下调（P < 0.05）,calreticulin转录水平虽有所上调,但差异不明显。以上结果表明,PCV2在感染早期可抑制猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈能力。     

肉毒梭菌的荧光定量PCR检测方法

根据肉毒梭菌神经毒素基因设计的引物和探针,建立了肉毒梭菌荧光定量PCR快速检测方法。肉毒梭菌产生了典型的"S"型曲线,其他干扰菌都无扩增,说明引物特异性较好,检测灵敏度为1×103 cfu/mL。该方法能够实现肉毒梭菌的快速检测,具有灵敏度高、特异性好的特点。     

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。     

应用纳米磁珠实时荧光PCR检测非洲木薯花叶病毒

建立非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)灵敏快速的纳米磁珠实时荧光PCR检测技术,防止其传入中国。采用TaqMan探针结合纳米磁珠(magnetic nanoparticles, MNPs)技术,以外壳蛋白基因为目标基因,通过特异性及灵敏度试验建立MNP荧光PCR检测方法。成功建立了非洲木薯花叶病毒(ACMV)的MNP荧光PCR检测方法;该方法检测阈值约为13 pg DNA,比普通PCR及ELISA方法灵敏度高25倍;该方法具有良好的特异性,能够有效区分双生病毒属的ACMV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)及番茄严重曲叶病毒(ToSLCV)。MNP荧光PCR方法能够快速灵敏的检测茎叶样品中的ACMV,无需任何PCR后处理,交叉污染风险小,适于口岸检验检疫。     

转植酸酶基因玉米phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用

质粒分子以其良好的适应性被较多地用作转基因标准材料的替代品。本文根据转植酸酶基因玉米phyA2基因设计引物与探针,并构建了一种包含phyA2基因片段(243 bp)和内标基因片段(178 bp)的质粒分子pPZ。选取不同转基因模板DNA作用于phyA2特异性引物,PCR结果显示只有转植酸酶基因玉米出现131 bp的目的条带;选取不同转基因作物检测体系作用于质粒分子pPZ,只有以pPZ DNA为模板时出现目的条带(131 bp和88 bp)。同时采用pPZ质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA为标准对4个转植酸酶基因玉米混合样品(3.0%、1.0%、0.5%和0.1%)进行定量检测,t检验表明,2种标准产生的斜率、线性相关系数和定值结果没有显著差异。这些结果表明,pPZ质粒分子可以作为转植酸酶基因玉米替代品用于定性和定量检测。