堆型艾美耳球虫子孢子纯化

笔者通过比较不同成分脱囊液的子孢子脱囊效果和不同蔗糖密度梯度分离纯化堆型艾美耳球虫子孢子的纯化效果来探索较佳的分离纯化堆型艾美耳球虫子孢子的条件。通过试验证明10%鸡胆汁+0.75%(W/V)胰酶脱囊效果最好。75%(W/V)和20%(W/V)蔗糖密度梯度离心得到的子孢子回收率最高,且纯度最好,染色证明纯化后的堆型艾美耳球虫子孢子仍具有较高的活性。     

鸡柔嫩艾美耳球虫对宿主细胞凋亡的影响

为了研究柔嫩艾美耳球虫入侵与宿主细胞之间的相互关系,用纯化的柔嫩艾美耳球虫子孢子与MDBK细胞共培养,使球虫子孢子入侵MDBK（Madin-Darby bovine kidney）细胞,用终浓度6%乙醇进行凋亡诱导,通过Annex-in V/PI双荧光染色法和流式细胞术（FCM）对MDBK细胞凋亡水平进行检测。试验结果证明子孢子入侵细胞后,有子孢子入侵的细胞凋亡诱导显著被抑制（P〈0.05）,而未有子孢子入侵的细胞相继被凋亡诱导剂诱导凋亡。进一步揭示柔嫩艾美耳球虫子孢子具有独特的机制来延长宿主细胞的存活时间来确保它们能在细胞中存活并发育。     

雏鸡抗艾美耳球虫免疫血清对其腹腔巨噬细胞吞噬子孢子和裂殖子的影响初探

当在含有20%热灭活雏鸡抗艾美耳球虫免疫血清的培养基中加入巨噬细胞培养物后,30～120 min内,可以见到巨噬细胞对子孢子和裂殖子的吞噬作用增强,表现为吞噬子孢子和裂殖子的巨噬细胞数增多,和巨噬细胞中的子孢子和裂殖子数量要增多。同时可以观察到吞噬作用前,粘附在巨噬细胞表面的子孢子和裂殖子数量亦比对照组多.巨噬细胞的吞噬作用可以被番木瓜蛋白酶所阻断,表明吞噬作用与血清中 IgG 与寄生虫形成免疫复合物后与巨噬细胞的受体结合有关.子孢子在非灭活的新鲜血清组的存活率低于灭活血清组.在非灭活血清组约有90%的子孢子有萎缩肿胀,或空泡等现象.     

离体条件下球虫卵囊子孢子囊的释放

利用柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)为试验虫株,盖玻片、载玻片为实验材料,用拇指适当施加压力时,在400倍的光学显微镜下,观察了柔嫩艾美耳球虫卵囊破裂和子孢子囊释放的过程,结果发现,卵囊在适当压力的作用下,在卵囊一端发生破裂,随后子孢子囊逐个从破裂口处溢出,溢出后的子孢子囊内含有2个子孢子,说明球虫卵囊虽然对常规的消毒剂抵抗力很强,但是在鸡的消化道内,尤其在肌胃内球虫卵囊很容易破裂而释放子孢子囊。     

兔球虫病的诊断及虫种鉴定

为探讨兔球虫病的诊断方法,对新乡市某兔场以消瘦下痢为主要症状的病兔进行临床检查、粪便直接涂片检查、饱和食盐水漂浮检查,并对粪样中检出的球虫卵囊及其孢子化卵囊进行形态学观察和虫种鉴定。在粪便中检出大量的球虫卵囊,经鉴定,分别为盲肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、梨形艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和长型艾美耳球虫,最后确诊该兔场发生的是由多种艾美耳球虫混合感染引起的兔球虫病。     

斯氏艾美耳球虫生活史的研究

对斯氏艾美耳球虫的孢子形成过程和内生发育进行了观察。发现斯氏艾美耳球虫的孢子形成过程可分为卵囊质迁移期,孢子囊母体形成期,孢子囊形成期和子孢子发育成熟期四个阶段。当子孢子清晰可见及折光球出现时,即意谓着孢子形成的结束。孢子形成时间在27℃为72小时。内生发育阶段有两代无性生殖,第一代成熟裂殖体出现于感染的第6～7天;第二代出现于第9～10天。两代裂殖体各分A、B两型,其潜隐期为14天。     

柔嫩艾美耳球虫敏感株与抗药株子孢子膜脂流动性的检测

建立了应用荧光探针1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)测定柔嫩艾美耳球虫子孢子膜脂流动性的方法。对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的敏感株与各种抗药株共13个球虫株的子孢子膜脂流动性进行测定。结果表明,敏感株的膜脂流动性大,抗药株膜脂流动性小(P0.01,呈极显著相关)。由此可见,虫株对药物的敏感性可能与膜脂流动性有关,膜脂流动性的检测结果可作为判别柔嫩艾美耳球虫对离子载体类抗球虫药物敏感性或抗药性的指标之一。     

细胞凋亡对柔嫩艾美耳球虫入侵的影响

为了研究球虫与宿主细胞间相互关系,利用含有6%乙醇的DMEM完全培养基培养对MDBK细胞进行凋亡诱导,通过膜联蛋白V(Annexin V)/PI染色法、HE染色法和吖啶橙染色法来鉴定MDBK细胞的凋亡情况。蔗糖密度梯度离心法获得的柔嫩艾美耳球虫子孢子与诱导凋亡的细胞共培养1 h后,利用HE和吖啶橙染色法来研究子孢子入侵细胞的状况。结果显示,在诱导凋亡的细胞中,没有发现柔嫩艾美耳球虫的子孢子,对照组未诱导凋亡的细胞中有子孢子入侵。表明球虫无法入侵诱导凋亡的细胞,进一步揭示了球虫在入侵过程中可能存在的识别机制和入侵机制,为将来开发新疫苗和新药物提供了基础数据。     

兔球虫病的诊断及虫种鉴定

探讨兔球虫病的诊断方法,为兔球虫病的诊断和防治提供理论依据.对河南省新乡市某兔场以消瘦下痢为主要症状的病兔进行临床检查、粪便直接涂片检查、饱和食盐水漂浮检查,以及对粪样中检出的球虫卵囊及其孢子化卵囊进行形态学观察和虫种鉴定.结果发现,粪便中检出大量球虫卵囊,分别为盲肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、梨形艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和长型艾美耳球虫,因此,确诊该兔场发生的是由多种艾美耳球虫混合感染引起的兔球虫病.     

杭州地区鸡球虫种类研究

对杭州地区的杭州市区、桐庐及建德等地的大型鸡场及个体养鸡场球虫感染情况进行了调查，通过对球虫卵囊的分离、培养，孢子生殖阶段虫体的形态观察，卵囊、孢子囊大小及卵囊孢子化时间的测定，初步将卵囊分为A型、B型、C型三种类型。分别用这三种卵囊接种雏鸡纯繁后，收集的卵囊人工感染15日龄的小鸡，观察并记录接种后的发病时间，症状及病理变化等，参照有关文献，鉴定球虫种类。经分析判定，杭州地区主要存在3个种，它们分别是柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella)，毒害艾美耳球虫（E.necatrix)和巨型艾美耳球虫（E.maxima)。     

西杂肉牛球虫病的诊断与虫种鉴定

[目的]为肉牛球虫病的诊断和防治提供依据。[方法]通过对新乡市某肉牛场患出血性肠炎的西杂肉牛进行临床检查,粪便直接涂片检查和饱和食盐水漂浮检查,并对粪样中分离的球虫卵囊及其孢子化卵囊进行形态学观察和虫种鉴定。[结果]在粪便中检出大量球虫卵囊,球虫经鉴定分别为艾美耳属的牛艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫、巴西艾美耳球虫、巴克朗艾美耳球虫和椭圆艾美耳球虫,确诊该牛场的出血性肠炎是由多种牛球虫混合感染引起的牛球虫病,其中,牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫为该肉牛场的优势种。[结论]临床检查、粪便实验室检查和虫种鉴定是诊断肉牛球虫病的一套简便实用方法。     

鸡艾美耳球虫阶段性抗原的分子生物学研究进展

从裂殖子表面抗原、细胞器抗原、子孢子抗原3个方面,综述了鸡艾美耳球虫阶段性抗原的分子生物学研究。     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的制备及纯化试验

自实验感染堆型艾美耳球早熟减毒株卵囊的雏鸡小肠内容物中得到裂殖子悬液,在直径1.5cm、高5cm的DEAE52层析柱中,用PH7.6Tris—Hcl、以0.5～1.5ml/分钟流速洗脱纯化,得到纯净的裂殖子,回收率为50.49％～56.2％。     

对氯间甲酚及复方对氯间甲酚对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的抑杀效果

为验证苯酚类消毒剂对鸡球虫卵囊的抑杀作用,采用不同浓度的单体和复方对氯间甲酚消毒剂与未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊共孵育,检测其对卵囊孢子化率的影响;与孢子囊共同孵育,通过子孢子脱囊率评价其对子孢子释放的干扰。孢子化卵囊经过不同浓度消毒剂直接浸泡、粪便干扰下浸泡或喷雾处理后经口接种雏鸡,通过OPG和盲肠病变记分探究消毒剂处理对卵囊的繁殖力和鸡的致病性的影响。结果显示, 2种消毒剂均可使孢子化率和子孢子脱囊率显著下降,且3种浓度的复方对氯间甲酚与3%氨水对照组（PC）的消毒效果无显著差异。直接浸泡处理试验结果显示,2%和3%复方对氯间甲酚 （HTS2和HTS3）具有更为显著的抑杀效果,与PC无显著差异;粪便干扰试验结果显示,粪便作用下这两种消毒剂对球虫卵囊仍有理想的抑杀效果;喷雾处理试验结果显示,3%对氯间甲酚（HT3）对球虫卵囊抑杀效果最好,显著优于PC组（P＜0.05）,而2%对氯间甲酚（HT2）、HTS2和HTS3组的抑杀效果与PC组无显著差异。研究结果表明,不同浓度下这2种消毒剂对孢子化和未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊都有一定的抑杀作用,综合比较,复方对氯间甲酚消毒剂具有更强的抑杀球虫卵囊效果,具有代替氨水成为鸡球虫消毒剂的潜能。     

柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析

根据柔嫩艾美耳球虫子孢子微线蛋白2的cDNA序列,利用计算机设计l对引物,以柔嫩艾美耳球虫杂交株子孢子总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出1个片段。把这个片段克隆到pMD18-T载体,经酶切鉴定得到1个阳性克隆,测序及序列分析结果表明该片段为MIC2基因,开发阅读框（0RF）与E．tenella豪顿株MIC2核苷酸同源性为99.51％,推导的氨基酸序列同源性为99.12％,说明MIC2基因高度保守。     

柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫在鸡胚培养和鸡肾细胞中的发育

采用体外脱囊的方法,将柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和堆型艾美耳球虫(E.aceroulina)的子孢子分别接种于9日龄 SPF 鸡胚的尿囊腔和鸡肾原代细胞中,置40～41℃恒温箱中培养.E.tenella 子孢子接种 SPF 鸡胚尿囊腔后,24h 后发现早期的第一代裂殖体;34h 后可观察到成熟的第一代裂殖体和裂殖     

CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对黄色荧光蛋白表达调控作用的研究

探索CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对串联型黄色荧光蛋白(YFP)表达的调控作用,将含有串联型YFP、CMV启动子、柔嫩艾美耳球虫组蛋白4(Histone4)上游启动序列和肌动蛋白(Actin)下游调控序列的重组载体pCMV-YFP-YFP、pH4-YFP-YFP-ACT电转染Vero细胞和柔嫩艾美耳球虫子孢子,观察荧光情况.结果证明,CMV启动子不能驱动YFP在柔嫩艾美耳球虫中正常表达,而其自身基因的侧翼序列能够启动和调控串联型YFP在柔嫩艾美耳球虫中的正常表达.     

斯氏艾美耳球虫体外脱囊过程中孢子囊余体的形态学和组织化学研究

本研究观察了斯氏艾美耳球虫Eimeria stiedai子孢子体外脱囊过程中孢子囊余体的变化,并用组织化学技术研究了其化学特性。发现在子孢子脱囊的初期,即斯氏体离去和子孢子脱出之前,孢子囊余体已分散到整个孢子囊内,呈颗粒状,运动性强。第1个子孢子脱出后,余体颗粒密集于第2个子孢子周围,活动剧烈。脱囊完成后,余体颗粒向一起集中,在孢子囊钝端形成圆球状体,周围似乎有膜包围,此时巳失去运动性。组织化学研究证明,斯氏艾美耳球虫孢子囊余体含有多量的多糖、脂肪及蛋白质。同时还发现,孢子囊余体内有较强的酸性磷酸酶活性。     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子在鸡胚小肠上皮细胞中的发育研究

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子在鸡胚小肠上皮细胞体外培养中完成了全部的内生性发育过程     

饱和食盐水漂浮鸡球虫卵囊的用量和处理时间研究

饱和食盐水是球虫卵囊分离纯化常用试剂,为降低鸡球虫病活疫苗生产成本,试验比较了不同用量的饱和食盐水对柔嫩艾美耳球虫卵囊的漂浮效果,同时研究了饱和食盐水处理柔嫩艾美耳球虫卵囊对其孢子化的影响。结果表明:饱和食盐水的使用量并非越多越好,4～6倍体积的饱和食盐水可获得最佳漂浮效果,且饱和食盐水处理卵囊的时间不宜超过30 min。