反向遗传操作技术在流感病毒研究中的应用

笔者从流感病毒及其基因组特征方面介绍病毒反向遗传操作技术体系的建立;从克隆的cDNA产生负义RNA病毒的概况方面,重点叙述流感病毒反向遗传操作技术的发展与应用前景。     

反向遗传操作技术在猪瘟基础理论研究中的应用

反向遗传操作技术的问世为RNA病毒的研究铺平了道路,研究人员根据需要在DNA水平上对RNA病毒进行加工和修饰,进而深入研究RNA病毒的本质和开发新产品。自反向遗传操作技术在猪瘟病毒上应用以来,在对猪瘟病毒致病机理、分子表达调控机制、细胞生长特性、毒力决定基因等方面的研究已取得明显进展。本文就反向遗传操作技术在猪瘟病毒基础理论研究中的应用作一综述,通过了解病毒基因组的功能、病毒与宿主致病力的关系以及病毒增殖特性等,为研究开发理想猪瘟标记疫苗开拓思路。     

核衣壳蛋白及“六碱基规则”在新城疫病毒复制中的作用

新城疫病毒 (ＮＤＶ)属于副粘病毒科副粘病毒亚科腮腺炎病毒属。是一种有囊膜的单股负链ＲＮＡ病毒 ,病毒ＲＮＡ包裹于核衣壳结构中 ,病毒粒子含有 6种结构蛋白核衣壳蛋白ＮＰ(ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ)、磷蛋白Ｐ(ｐｈｏｓｈｏｐｐｒｏｔｅｉｎ)、基质蛋白Ｍ(ｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎ)、融合蛋白Ｆ(ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ)、血凝素＿神经氨酸酶ＨＮ(Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ＿Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ)和ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶Ｌ ,其中ＮＰ、Ｐ、Ｌ外加上几种细胞的蛋白组成转录复合体。转录复合体中的核…     

反向遗传操作技术在瘟病毒属研究中的应用

反向遗传操作技术已经成为研究瘟病毒属的一条有效的途径?针对反向遗传技术在瘟病毒属基因结构和功能研究?致病机制研究和新型疫苗研制中的应用以及瘟病毒属的感染性克隆策略的选择进行了综述,以期为预防?控制和消灭瘟病毒属病毒提供参考。     

鸡新城疫病毒培养技术及其在疫苗研究中的应用

鸡新城疫病毒(NDV)抗原的制备是鸡新城疫疫苗生产的关键环节,直接关系着疫苗的产品质量和免疫效果,安全高效的疫苗产品更是关系着鸡新城疫疾病的有效防控和养殖业的健康发展。近年来,人们在NDV培养技术以及相关疫苗开发方面做了大量卓有成效的研究工作,取得了不少新的成果。本文对这一领域的研究进展进行综述。     

抗新城疫病毒血凝素单克隆抗体的研制

新城疫是由新城疫病毒(NDV ) 引起的一种主要侵害鸡和火鸡的急性、高度接触性传染病, 危害极其严重.根据流行特点、临床表现和病理变化可对典型性新城疫作出诊断,但对非典型性新城疫的诊断及该病的确诊需借助于病毒的分离鉴定、血清学方法、直接病毒抗原检测等实验室手段.研制抗NDV单抗将为NDV的检测发挥重要作用,曹殿军等[1]已制备出抗新城疫病毒糖蛋白单克隆抗体,但抗NDV血凝素单抗国内少有报道,鉴此,本实验室用PEG融合技术,研制出分泌抗NDV血凝素蛋白杂交瘤细胞株.     

禽痘病毒载体在新城疫病毒重组疫苗研究中的应用

介绍了禽痘病毒粒子及其基因组的特点和禽痘病毒作为重组疫苗载体的优点 ,简述了构建禽痘病毒疫苗的基本方法和国内外以此作载体的新城疫病毒重组活疫苗的研究进展 ,认为以禽痘病毒作载体构建禽类重组疫苗具有广阔的应用前景。     

反向遗传操作技术在猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗研发中的应用

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种高度传染性疾病.该病自1987年首次发现以来,已遍及世界各个养猪国家[1],它所引发的母猪流产和仔猪的呼吸障碍给养猪业造成了灾难性的打击.特别是2006年以来,变异株PRRSV的出现则对我国养猪业的发展产生了巨大的影响[2].     

新城疫病毒核衣壳蛋白的结构和功能

新城疫病毒((Newcastle disease virus,NDV)是副黏病毒科副黏病毒亚科禽腮腺炎病毒属的成员之一,也是家禽的主要病原之一.NDV病毒粒子自然状态下呈多形性,大小150 nm～400 nm;病毒粒子内有长1 000 nm螺旋状的核衣壳结构,直径为17 nm～18 nm;囊膜上覆盖有直径8 nm～12nm 的糖蛋白纤突.NDV基因组为单股负链RNA,分子量5.2×106～5.7×106道尔顿.NDV基因组包括6个基因(31-NP-P-M-F-HN-L-51)编码至少8种蛋白(6种结构蛋白,和由P蛋白基因经RNA编辑,从移码了的阅读框翻译出2种非结构蛋白V和W蛋白).     

以rLaSota为骨架构建表达强毒株HN蛋白的嵌合体新城疫病毒

新城疫病毒(NDV)的HN蛋白是一个多功能蛋白,具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性,在病毒感染过程中扮演重要角色。本研究利用反向遗传操作技术,将NDV强毒株F48E9的HN基因替换弱毒株rLaSota的HN基因,获得嵌合病毒rL-F48E9HN。收获病毒尿囊液,提取基因组RNA,进行序列分析,结果显示嵌合病毒基因组的HN基因获得了正确替换。嵌合病毒在鸡胚内的生长特性与亲本株LaSota一致,与F48E9的生长特性相差甚远。嵌合病毒红细胞吸附性明显增强,较rLaSota株增加51%,而细胞融合作用无明显变化。rL-F48E9HN的鸡胚平均致死时间(MDT)为148 h,脑内致病指数(ICPI)为0.43,静脉接种致病指数(IVPI)为0,说明rL-F48E9HN的毒力仍然属于弱毒力范围,而没有达到中等毒力或者强毒力。     

基于F和HN蛋白的基因Ⅶ型新城疫病毒嵌合疫苗的构建及免疫效力评估

【目的】试验旨在构建一种基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)嵌合疫苗,并对其免疫效力进行评估。【方法】利用反向遗传学技术,以含有禽偏禽腮腺炎病毒2型(Avian metaavulavirus-2,AMAV-2)Y2株基因组的重组质粒pT7-Y2为模板,将Y2株的F和HN蛋白的胞外区替换为基因Ⅶ型NDV HB0901株的F和HN蛋白的胞外区,将HB0901株的F蛋白裂解位点突变为LaSota弱毒株的F蛋白裂解位点,构建嵌合重组病毒rY2-FHNR株。对rY2-FHNR株的增殖特性、致病力及遗传稳定性等生物学特性进行检测,并通过接种2周龄SPF鸡评估rY2-FHNR株的免疫原性及其免疫血清与Y2株的交叉反应性,利用NDV NP蛋白的间接ELISA方法对免疫血清进行检测,验证其鉴别诊断效果。【结果】试验成功获得了嵌合重组病毒rY2-FHNR株,生物学特性检测结果显示,rY2-FHNR株在鸡胚中的增殖滴度和致病性符合弱毒特征,其鸡胚传代的遗传稳定性良好。rY2-FHNR株可诱导机体产生针对NDV的抗体,且免疫血清不与rY2株抗原发生交叉反应。通过NDV...     

特异抗体致敏的SPA茵体浓缩新城疫病毒方法在临床诊断中的应用

为提高新城疫临床诊断的准确率,建立了新城疫病毒浓缩方法,将粪便及脑、肺等器官组织病料中的新城疫病毒经特异性抗体致敏的金黄色葡萄球菌(SPA菌)吸附浓缩后,用RT-PCR进行检测.结果表明,所建立的新城疫病毒浓缩方法应用于临床诊断后,可显著提高检测敏感性,从而提高临床诊断的准确率.     

抗新城疫病毒糖蛋白单克隆抗体的研制及在免疫组化中的应用

应用纯化的新城疫病毒(NDV)La Sota野毒株免疫Balb/c小鼠,最后一次免疫后3 d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选到3株分泌抗NDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对各株单克隆抗体免疫球蛋白亚类及ELISA效价进行测定.结合单克隆抗体反应结果,鉴定出抗NDV NP蛋白的单克隆抗体,利用该单克隆抗体s3e1做免疫组化试验,用rLa Sota(重组La Sota第2代毒株)免疫2日龄雏鸡,接种后第5天检测到肝脏的部分肝细胞呈阳性反应.     

反向遗传学技术及在RNA病毒研究中的应用

RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入DNA基因片段,实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作,为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来,RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这在很大程度上归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。文章介绍了反向遗传学技术的基本特点、技术方法及其在正、负链RNA病毒的基因功能、致病机制及新型病毒载体等方面的研究及应用情况。     

特异抗体致敏的SPA菌体浓缩新城疫病毒方法在临床诊断中的应用

为提高新城疫临床诊断的准确率,建立了新城疫病毒浓缩方法,将粪便及脑、肺等器官组织病料中的新城疫病毒经特异性抗体致敏的金黄色葡萄球菌(SPA菌)吸附浓缩后,用RT-PCR进行检测。结果表明,所建立的新城疫病毒浓缩方法应用于临床诊断后,可显著提高检测敏感性,从而提高临床诊断的准确率。     

反向遗传学技术在新型疫苗研制中的应用

随着分子生物学等学科的发展,出现了许多可以应用于疫苗研制的新方法和新技术,并在某些方面已经开始逐步取代传统的疫苗研制技术。其中,反向遗传学技术发展迅速,倍受国内外研究者关注。这项技术不仅为解析病毒蛋白在病毒复制周期和致病性中的作用提供了有效的研究工具,而且为研发RNA病毒为载体疫苗提供了新的思路和策略[1-4]。     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物     

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。     

新城疫病毒（NDV）基质（M）蛋白在体身对炎症因子诱导的作用

新城疫是当今全球范隔内最严重的家禽传染病。为了更好的预防新城疫，需要对病毒的致病性以及对宿主的免疫反应等分子机制进行更好的研究。