农杆菌介导反义油酸脱饱和酶基因转化甘蓝型油菜

以甘蓝型油菜花油3号的子叶柄作为转化受体,利用农杆菌介导法,将反义油酸脱饱和酶基因导入甘蓝型油菜,获得了卡那霉素抗性植株。对再生植株进行PCR-Southern blotting检测,证明外源基因已整合到油菜基因组中。本文还进一步分析了影响遗传转化的一些因素。结果表明：对子叶柄进行适当的预培养,可以提高转化效率。延迟筛选也有利于提高转化效率。将处于对数生长期的农杆菌菌液稀释10倍后,外植体浸泡5-7min的转化效果最佳。     

大豆FAD2-1b 基因沉默载体的构建

旨在培育生物安全的转基因大豆。设计引物、采用RT-PCR从高蛋白大豆品种‘黑农35’中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆‘黑农37’中克隆FAD2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆品种中克隆FAD2-1b基因片段,作为正向臂和反向臂。连接这些目的片段,构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为FAD2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,扩增得到的重组质粒经酶切和序列分析鉴定正确,命名为pDT-FAD2I。本研究构建了针对大豆FAD2-1b基因的沉默载体,为进一步获得FAD2-1b基因沉默大豆,培育转基因安全的高品质大豆奠定了基础。     

农杆菌介导的ICE1基因转化番茄的研究

以番茄品种组培大黄为试验材料,通过农杆菌介导法,将来自拟南芥的抗寒基因ICE1导入番茄,并对影响遗传转化的因素进行了优化。结果表明,高效稳定的遗传转化体系培养基为MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L;子叶预培养2d,农杆菌菌液浓度OD600=0.4,侵染10min,共培养36h,抑菌抗生素300mg/L。获得抗性植株5株,PCR扩增和RT-PCR检测表明有3株阳性植株,转化率为60%,初步表明ICE1基因已导入到番茄中。     

农杆菌介导法将DREB2A基因转入玉米

通过农杆菌介导法将耐盐基因DREB2A转入玉米自交系H99以及杂交种H99×A188中,同时研究了农杆菌浓度、侵染时间和AS浓度等因素对转化效率的影响。研究表明:农杆菌菌液浓度在OD值为0.5~0.6时农杆菌感染能力最强,适宜的侵染时间为20min;共培养基中乙酰丁香酮(AS)的适宜浓度为150μmol/L。通过该优化体系获得的转基因植株110株,经PCR分析鉴定,其中5株表现阳性,初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中。     

根癌农杆菌介导的番茄高效遗传转化体系的研究

以番茄无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了优化,建立了高效番茄子叶和下胚轴农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.3)进行2 d的预培养浸染6 min的外植体在MS+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L IAA的培养基上转化效率最高.PCR检测初步证明,NPTII基因已整合到番茄再生植株中.     

农杆菌介导的玉米合子基因转化

本研究建立了农杆菌介导的玉米合子转化方法。用农杆菌介导合子转化方法,以含有bar基因的标准双元载体PTF102和含有bar基因和双价抗虫基因Cry1A（a）或Cry1A（c）、PTA（半夏凝集素）的载体p3300-Bt-pta转化玉米自交系吉8902、丹340、吉4112、吉853、铁7922及PA91,直接从受体植株得到转化种子,用除草剂PPT筛选和PCR鉴定,获得转基因植株及后代。实验分析了2002年、2003年和2004年的3批转化操作的结实率、转化率及转基因的遗传情况：经农杆菌侵染的雌穗平均结实率为39％,合子转化频率达1％以上,转基因可以遗传下去。农杆菌介导玉米合子转化方法可以重复获得成功,表明我们成功建立起一个新的不依赖组织培养的玉米转基因技术体系。     

农杆菌介导大豆胚尖转化体系的研究

以大豆"黑农37"胚尖为外植体,利用农杆菌介导法将抗除草剂基因EPSPS转入大豆,并对转化各培养阶段6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)浓度进行了优化。结果表明:在预培养和共培养培养基中加入较高浓度6-BA有利于抗性芽的诱导;1mg/L6-BA和0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)配合使用有利于抗性芽的伸长且提高了抗性芽的再生率;将抗性芽添加在1mg/L IBA的培养基中培养7d后转入不加任何激素的培养基中生根快且移栽后成活率高。PCR结果初步证明将EPSPS基因转入到大豆中。     

农杆菌介导的BcWRKY2基因原位转化玉米茎尖的初步研究

利用农杆菌介导的原位转化方法将植物抗旱相关转录因子BcWRKY2基因导入优良玉米自交系郑58、K10、黄早四和M017.采用正交设计对玉米品种、菌液浓度、乙酰丁香酮浓度(AS)、真空处理时间和表面活性剂Silwet-77浓度进行了优化.研究结果表明,各因素对转化率影响顺序依次是菌液浓度＞品种＞ AS浓度＞真空处理时间＞Silwet-77浓度.确定了最优转化条件为品种郑58、真空处理时间20min、菌液浓度为OD600=0.9、AS浓度100μmol/L、Silwet-77浓度0.05％.PCR及RT-PCR分子检测试验说明,BcWRKY2基因已经整合到玉米基因组中,并且得到表达.     

农杆菌介导水稻BADH2基因RNA干涉表达载体的转化

利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导将水稻BADH2的RNAi载体导入多个水稻品种幼胚、成熟胚诱导的愈伤组织。试验表明，不同外植体来源影响愈伤组织的诱导和转化，并且愈伤组织的诱导和转化效果受基因型的影响。在农杆菌转化过程中，潮霉素和除草剂都是较好的筛选剂，前者筛选所得的抗性愈伤分化成苗所需时间较短；但后者筛选所得的抗性愈伤形成的苗更健壮。T0代PCR检测表明，通过转化确已获得一定数量的转基因植株。     

RNAi介导SMV-P3基因沉默增强大豆对花叶病毒病的抗性

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是我国各大豆主产区最重要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒外观品质。培育抗病品种是防治该病最经济有效的措施。本研究基于植物介导RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,将编码参与SMV运动和影响宿主域范围的P3蛋白基因RNAi片段导入栽培大豆品种,研究RNAi介导SMV-P3基因沉默对大豆抗SMV的影响。Southern杂交检测结果表明,外源RNAi片段以低拷贝的形式(1~4个)整合至大豆基因组中。对T1~T3代转基因大豆喷施除草剂和PCR鉴定结果表明,外源T-DNA插入片段在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。对T2和T3代转基因大豆接种SMV鉴定结果表明,转基因大豆对我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3较非转基因对照受体品种Williams 82和SN9的抗性水平显著提高,病情指数降低至4.37%~18.51%,且抗性能够稳定遗传。综上所述,RNAi介导SM-P3基因沉默能够显著提高转基因大豆对SMV的抗性水平。     

大豆GmMYB12B2植物表达载体的构建及转化烟草

为研究大豆MYB转录因子-GmMYB12B2在转基因植物类黄酮代谢中的作用,利用吉林大学植物种质资源与利用研究室前期克隆的GmMYB12B2基因,以PPZP质粒为表达载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动GmMYB12B2基因的植物表达载体PPZP-GmMYB12B2;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行遗传转化。经PCR随机扩增鉴定9株转基因烟草,其中有6株是阳性植株,初步证明已获得转大豆GmMYB12B2基因的烟草。     

Construction of RNAi Vector of Cotton (Gossypium hirsutum L.) FAD2-1 Gene and Acquisition of New High Oleic Acid Germplasm

[Objective] Here, the aim was to create a new cotton (Gossypium hirsutum L.) germplasm with high oleic acid and low linoleic acid contents without affecting the fiber yield and quality. [Method] The fatty acid desaturation 2-1 (FAD2-1) gene catalyzes the formation of polyunsaturated linoleic acid from monounsaturated fatty acid in cotton. The protein’s properties, structure and functions were analyzed using the information analysis method. A conserved 381-bp fragment of GhFAD2-1 was cloned to construct an RNA interference vector, which was transformed into cotton by Agrobacterium-mediated hypocotyl infection. The fatty acid compositions and contents of T₂―T₄ transgenic plants were determined using gas chromatography-mass spectrometry. The T₄ transgenic lines were used to investigate the copy number, target gene expression, agronomic traits, and fiber quality. [Results] The RNA interference vector of GhFAD2-1 was successfully constructed and transformed into cotton. The target gene’s expression level was significantly lower in transgenic plants than in controls. The transgenic plants had high oleic acid and low linoleic acid contents, which could be stably inherited by the offspring. The oleic acid contents of transgenic cotton seeds increased by 224.1%, and the linoleic acid content decreased by 237.5%, compared with the control seeds. There were no significant differences in the agronomic traits and fiber quality of the transgenic lines compared with the control. [Conclusion] These results verified the function of GhFAD2-1 in cotton and provide a basis for breeding cotton varieties with high oleic acid contents.     

花生ahFAD2A等位基因表达变异与种子油酸积累关系

花生ahFAD2A是控制种子油酸、亚油酸含量和油亚比的关键基因。利用ahFAD2A基因特异引物检测远杂9102, 豫花9416等52个花生品种的ahFAD2A基因等位变异, 并比较其中13个品种的ahFAD2A基因序列。结果表明, 花生ahFAD2A基因存在G-A两种单核苷酸等位变异(野生型ahFAD2A-wt和突变体ahFAD2A-m), DNA序列比对结果证实, 豫花9416等10个品种(突变体)与远杂9102、延津花籽和开农白2号(野生型)相比, 在ahFAD2A基因的448 bp处存在核苷酸G-A突变。应用real-time PCR检测ahFAD2A等位基因在种子不同发育时期的表达动态显示突变体豫花9416等位基因(ahFAD2A-m)在种子发育中期表达量稍高, 种子发育后期表达量下降速度较野生型远杂9102(ahFAD2A-wt)更快。进一步测定豫花9416和远杂9102在种子不同发育时期的油酸、亚油酸积累和油亚比动态, 发现两品种间存在明显差异, 豫花9416在籽粒发育前期油酸相对含量已超过亚油酸, 油亚比大于１并逐渐增加, 而远杂9102到籽粒发育中后期油酸相对含量才高于亚油酸, 油亚比逐渐接近于１左右。     

分子标记辅助选择改良甘蓝型油菜种子油酸和亚麻酸含量

本研究以甘蓝型油菜SW HickoryxJA177产生的SJ DH群体为材料,利用混合分离群体法(Bulked Segregant Analysis,BSA)的原理快速筛选到2个SSR分子标记(BRMS007和BRGMS630)与油酸含量相关,4个SSR分子标记(sN2025,BoGMS798,Na12 D09和OI1...     

利用基因芯片技术研究甘蓝型油菜油酸合成中差异表达基因

采用基因芯片技术对甘蓝型油菜高油酸(71.71%)和低油酸(55.6%)材料进行分析,探索油酸的差异表达基因。结果检测到差异表达基因562个,其中上调表达基因194个,下调表达基因368个。以基因芯片中油菜上调基因NM_100489和下调基因NM_130183为材料,用实时荧光定量方法验证基因芯片的结果,二者完全相符。根据基因芯片的实验结果,采用Go注释系统和数据库查询对562个差异表达基因进行功能注释表明,主要为各种酶类、结合功能、转录调控、代谢等,还有的功能未知或与糖代谢及脂肪酸合成相关,其中丙酮酸激酶、果糖二磷酸、酰基传递/酰基ACP硫脂酶、作用于酯键的水解酶、Δ9硬脂酰-乙酰载体蛋白去饱和酶(ADS1)、Δ9酰基-油脂减饱和酶2(ADS2)、ω-3脂肪酸减饱和酶(fad3)等被鉴定为差异表达基因。     

花生AhFAD2的基因型与O/L值的相关性分析

花生(Arachis hypogaea L.)高油酸性状受2对同源非等位隐性基因ol1和ol2调控,分别编码Ah FAD2A和Ah FAD2B。本研究利用红外无损检测技术分析不同花生品种的油酸、亚油酸及粗脂肪含量,并设计等位基因特异引物,对不同油亚比值的12个花生品种进行AS-PCR检测分析。结果表明:对12个花生基因型均能准确分析出Ah FAD2基因型,其中1514、606、9102、614和1474的基因型为OL1OL1OL2OL2,其相应的O/L值位于0.971~1.759;花17、1513、1476和1586的基因型是ol1ol1/OL2OL2,其相应的O/L值位于2.252~3.679;1504、1505和1515的基因型为ol1ol1ol2ol2,其相应的O/L值位于8.204~12.79。综合12个花生品系籽粒O/L值和Ah FAD2基因型的相关性结果表明,基因型的改变直接导致O/L值的变化,但与含油量无特定相关性。     

不含 SBTI-A_2的基因导入我国大豆的遗传表达

大豆 Glycine max(L.)Merrill 种子中的主要营养抑制因子是 Kunitz 胰蛋白酶抑制剂(SBTI—A_2)。经利用标准 SBTI 比较谱带的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析方法,证实了我国栽培大豆中豆19、临沂81-551、通县元豆、中作84-C_(42)和中作84-C_(02)均属 Ti~aTi~a 型。并利用上述5个黄淮海夏大豆品种或品系与美国不含 SBTI-A_2(titi)品系 L_(81-4590)和 L_(83-4387)杂交,在7个组合的 F_2代中得到了 titi 型。其表型比例为3∶1,符合孟德尔单基因遗传规律。进一步的研究正在进行中。     

中品95-5117抗大豆花叶病毒基因源分析

中品95-5117和中品95-5383是以中品661为亲本选育的抗东北花叶病毒病3号株系(SMV3)的大豆新品系。中品95-5383抗病基因的SCAR标记已被定位于大豆F连锁群(Chr.13),与抗病基因Rsv1紧密连锁。利用大豆F连锁群的34个对SSR标记引物及与抗病基因紧密连锁的SCAR标记SCN11及Rsv1候选基因标记Rsv1-f/r,对中品95-5117系谱亲本进行检测,结合对SMV3的抗性鉴定结果进行分析,旨在明确抗SMV3基因在系谱中的传递规律,为利用分子标记辅助选择培育抗SMV3新品种提供依据。通过SSR标记分析发现,中品95-5117和中品95-5383与亲本中品661的相似性最高,而与另外一个亲本鲁豆4号关系较远。SCAR标记SCN11检测表明,只有1份材料Mangnolid(F-53)B为感病基因型。系谱的Rsv1-f/r标记分析表明,Williams82是中品95-5117中Rsv1基因的供体亲本。抗病性鉴定发现鲁豆4号高抗SMV3,但它并不携带Rsv1基因。据上述结果推测中品95-5117中不仅含有Rsv1,还具有来自鲁豆4号的抗病基因,证明该品系比其亲本中品661具有对SMV3更强的抗性。     

大豆KTI1基因表达方式分析及其启动子预测

为明确大豆胰蛋白酶抑制剂基因(KTI1)在不同逆境、ABA条件下及大豆不同组织中的表达方式,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测,结果表明KTI1基因受低温、盐、干旱和ABA诱导,分别在处理10、5、24和lh时获得诱导最高值,相对表达量分别是未处理的288.65,274.35,136.04和56.48倍;KTI1基因...