陆地棉Dof基因家族的全基因组鉴定及分析

【目的】单锌指DNA结合蛋白(DNA binding with one finger, Dof)是1类植物特有的转录因子,在植物生长发育与非生物胁迫响应中发挥非常重要的作用。本研究旨在对陆地棉Dof转录因子家族进行全基因组分析,为深入研究Dof基因参与植物生长发育的调控机制提供参考。【方法】基于最新发布的陆地棉基因组数据,利用生物信息学手段对陆地棉Dof基因家族进行全基因组鉴定,并系统分析Dof基因家族成员的理化性质、序列特征、基因复制、系统进化和表达谱。【结果】陆地棉中一共鉴定出118个Dof基因。经聚类分析将其分成9个亚家族,同一亚家族的陆地棉Dof基因有相似的内含子/外显子和基序分布模式。基因复制分析表明,全基因组复制可能导致陆地棉Dof基因的扩增。陆地棉Dof基因启动子区域存在不同植物激素和逆境胁迫响应元件。转录组分析表明,陆地棉Dof基因在不同的组织、发育时期和逆境胁迫下聚为3个表达模式不同的类群,暗示了其功能多样性。【结论】陆地棉Dof基因家族的全基因组鉴定和分析,有助于了解其进化和功能,为后续研究提供重要参考。     

陆地棉基因GhMYB52的克隆及特征分析

【目的】克隆了1个在棉纤维发育次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)转录因子基因Gh MYB52(Gh_A12G2460)。本研究旨在分析该MYB转录因子在陆地棉纤维次生壁发育过程中的作用。【方法】通过一步克隆法,从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆了1个在纤维次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB转录因子基因Gh_A12G2460,进化树分析结果表明Gh_A12G2460与拟南芥中AtMYB52基因的相似度最高,因此将其命名为Gh MYB52。通过进化树构建、氨基酸序列多重比对、定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、烟草瞬时转化、酵母双杂交等对其基因结构、编码产物的结构、表达特征、亚细胞定位以及互作蛋白进行了分析。【结果】GhMYB52基因的开放阅读框长672 bp,编码223个氨基酸残基,预测蛋白的相对分子质量为26.06 kDa,等电点为9.83。qRT-PCR结果表明,Gh MYB52基因在开花后15～25 d的棉纤维中优势表达。亚细胞定位结果显示,GhMYB52蛋白定位于细胞核,符合转录因子的特征。酵母转化结果显示,GhMYB52蛋白具有强烈的转录激活活性,并且与1个NAC类转录因子GhFSN1有强烈互作。【结论】GhMYB52是1个在棉花纤维次生壁加厚时期优势表达的R2R3类MYB转录因子,它可能通过与NAC类转录因子互作,形成蛋白复合物参与棉花纤维次生壁加厚过程。本研究为进一步从分子水平上验证GhMYB52基因在棉花纤维发育过程中的生物学功能奠定了基础。     

陆地棉MADS-box家族基因鉴定及组织特异性表达分析

【目的】MADS-box蛋白是1种重要的转录因子,参与调控棉花生长发育进程。鉴定分析陆地棉MADS-box家族基因,可为研究其生物学功能奠定基础。【方法】基于2019年最新组装的陆地棉TM-1参考基因组,通过HMMER 3.0软件鉴定陆地棉TypeⅠ型及MIKC型MADS-box基因。利用MapInspect、MEGA7.0、MEME和TBtools软件以及omicshare网站进行染色体定位、多序列比对聚类分析、Motif预测、基因结构鉴定以及组织特异性表达分析。【结果】从全基因组水平上鉴定出181个陆地棉MADS-box基因(66个TypeⅠ型和115个MIKC型),染色体定位发现该181个基因在陆地棉26条染色体上均有分布,其中A组染色体上分布有78个基因、D组上分布有103个基因。系统进化分析显示TypeⅠ型MADS-box蛋白有3个亚家族,MIKC型蛋白包括MIKC*型和含有10个亚家族的MIKCC型;motif预测结果显示所有MADS-box蛋白均含有MADS结构域,基因结构分析结果显示,外显子、内含子结构和长度在各亚家族内具有同一性;组织特异性表达分析发现MADS-box家族基因中有33个在纤维组织中优势表达,103个在花器官中优势表达,41个基因在根茎中优势表达。【结论】本研究通过生物信息学方法,鉴定并获得了与陆地棉开花调控和纤维发育相关的MADS-box基因,对于揭示棉花纤维品质等重要性状的遗传调控机制及分子育种具有一定的理论意义和应用价值。     

陆地棉漆酶基因家族鉴定及在黄萎病菌胁迫下的表达分析

黄萎病是降低棉花产量和品质较为严重的维管束病害。棉花在抵抗病原菌的过程中,抗病基因起着尤为重要的作用。漆酶是一种多功能氧化酶,在植物木质素合成和提高植株抗逆性等方面发挥着重要作用。高质量版本的基因组是提升基因家族分析准确性的必要条件。本研究以目前最新的陆地棉TM-1高质量版本基因组为参考,通过生物信息学分析鉴定了陆地棉基因组中的Laccase(GhirLAC)基因家族,并对其进行了理化性质、基因结构、染色体定位以及在黄萎病胁迫下的表达模式分析。结果表明,陆地棉TM-1基因组中共包含83个GhirLAC家族成员,分布在24条染色体上,所有GhirLAC蛋白均定位在胞外,且具有相同/相似的保守基序。系统发育树分析显示,GhirLAC基因家族成员可分为7个亚组。结合黄萎病胁迫下棉花转录组数据,将GhirLAC基因家族各成员的表达分为3种模式,其中第1类和第2类GhirLAC基因在黄萎病菌胁迫下分别呈现有规律的表达量升高和降低,推测这些基因在棉花抗黄萎病反应中发挥重要功能。荧光定量PCR结果表明,GhirLAC02(GhLAC4)、GhirLAC38(GhLAC11)和GhirLAC20(GhLAC12)3个候选基因均受黄萎病菌诱导表达,其表达趋势与转录组数据相吻合。本研究为以后深入解析棉花GhirLAC基因的抗病功能及分子机制奠定基础。     

棉花GhMGL11基因的克隆和表达分析

为研究陆地棉甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因的结构与功能,本研究以陆地棉中9807叶片为试验材料克隆得到棉花甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因c DNA全长,命名为GhMGL11(Cottongen:Gh_A12G2168)。蛋白序列分析该基因的编码区序列全长1 359 bp,编码452氨基酸;GhMGL11蛋白属于亲水性蛋白,预测含有41个磷酸化位点;亚细胞定位显示位于细胞质,无信号肽。序列比对分析,该基因含有Cys_Met_Meta_PP家族特有的保守结构域Cys_Met_Meta_PP,属于PLP(Pyridoxal phosphate)依赖性氨基转移酶中的一种。系统进化分析,陆地棉GhMGL11蛋白与可可(Theobroma cacao)亲缘关系较近。在陆地棉中发现23个与GhMGL11基因同源的含有Cys_Met_Meta_PP结构域的基因。组织特异性分析,GhMGL11基因在棉花根、茎、叶中均有表达,其中在根中的表达量最高;碱胁迫处理后不同时间内,该基因的表达量先升高后降低,说明该基因表达受碱胁迫影响。     

陆地棉LTPG基因家族的全基因组鉴定及表达分析

【目的】从陆地棉全基因组范围内鉴定糖基磷脂酰肌醇锚定的脂质转运蛋白(glycosylphosphatidylinositolanchored lipid transfer protein,LTPG)基因,为后续研究提供支撑。【方法】利用生物信息学方法从陆地棉TM-1基因组中筛选鉴定LTPG基因家族成员,并对其编码蛋白的理化性质、系统进化关系、基因复制、基因结构和启动子区的顺式作用元件等进行预测分析。利用转录组数据结合实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析LTPG基因在不同组织器官和非生物胁迫下的表达模式。在烟草叶片中采用瞬时转化法检测目标蛋白的亚细胞定位情况。【结果】在陆地棉基因组中共鉴定到95个GhLTPG基因,系统发育分析将这些GhLTPG蛋白聚为5类。片段复制是GhLTPG基因家族扩张的主要原因。K_a/K_s分析表明GhLTPG基因经历了强烈的纯化选择。转录组数据分析表明,部分GhLTPG基因响应低温、高温、盐和干旱胁迫。表达分析结果显...     

陆地棉KFB基因家族全基因组鉴定与表达分析

【目的】KFB(Kelch containing F-box protein)是普遍存在于各种生物体中含有F-box结构域的一类家族蛋白,参与众多生物过程。本研究旨在开展陆地棉KFB家族基因鉴定和表达分析。【方法】利用生物信息学方法从陆地棉(TM-1)基因组中鉴定KFB家族成员,与已知的拟南芥、水稻、大豆等KFB蛋白序列构建系统进化树;进一步针对第Ⅱ亚族进行基因结构、染色体定位和表达分析。【结果】从陆地棉基因组共鉴定出150个KFB家族成员,进化分析表明这些基因可分为7个亚族。陆地棉KFB第Ⅱ亚族24个基因分布在14条染色体上,有9对直系同源基因;该亚族基因结构简单,半数基因只有1个外显子;qRT-PCR结果表明,该亚族基因具有较为广泛的组织表达模式,但在不同组织的表达存在差异。【结论】这些结果显示陆地棉KFB第Ⅱ亚族基因在进化过程中出现了功能分化。     

棉花阿拉伯半乳糖蛋白基因的克隆、表达与染色体定位分析

陆地棉李氏超短纤维突变体(Li1li1)是显性单基因突变体,表现为茎秆、叶片卷曲,纤维短至6mm,其隐性纯合体(li1li1)则表现为株型和纤维发育都正常。对开花后10d的李氏纤维发育正常材料(li1li1)和超短纤维突变体(Li1li1)胚珠纤维混合体进行mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析,获得1条在李氏纤维发育正常材料中上调表达的差异片段。进一步通过5'RACE技术获得全长为621bp的cDNA,测序及DNA序列的生物信息学分析表明该cDNA片段与拟南芥编码阿拉伯半乳糖蛋白基因AGP14有52%相似性,故命名为GhAGP。表达特征分析表明,该基因在陆地棉根、茎、叶和纤维中组成性表达,在棉纤维中优势表达。基因组序列分析显示,该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中各有1个拷贝,在四倍体棉种陆地棉TM-1和海岛棉海7124中分别存在2个拷贝,表明A、D亚组中各有1个拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体,将GhAGP基因的2个拷贝分别定位在四倍体棉花部分同源转化群染色体6和染色体25上。     

陆地棉ZF-HD蛋白的全基因组分析

ZF-HD(Zinc finger-homeodomain)蛋白属于同源异型盒蛋白家族,在动植物发育过程中起重要的作用。利用生物信息学的手段,研究陆地棉标准系TM-1基因组中ZF-HD蛋白的数目、亚细胞定位、染色体分布、基序、进化关系和组织表达情况。TM-1中共有35个Gh ZHD蛋白成员,且大部分成员定位到细胞核内;分布在20条染色体和2条Scaffold上,且具有11对直系同源基因;进化树分析表明,TM-1基因组中的ZF-HD蛋白大致分为6个小组,每个小组成员间具有类似的基序类型和排列顺序;大部分Gh ZHD基因在胚珠和纤维组织中表达,还有部分基因在根、茎、花、蕾和分生区中表达,在叶和愈伤组织中表达的基因最少。     

两个棉花ß-葡聚糖酶新基因的结构与表达特征分析

β-葡聚糖酶是一类能降解β-葡聚糖的水解酶。本研究分别通过电子克隆和棉纤维发育cDNA文库筛选法克隆到2个棉花β-葡聚糖酶新基因,内切-1,4-β-葡聚糖酶基因(GhEG,GenBank登录号为HM462003)和1,3-β-葡聚糖酶基因(GhGLU,GenBank登录号: HM462004)。GhEG全长ORF为1 581 bp,编码526个氨基酸残基。GhGLU全长ORF为1 410 bp,编码469个氨基酸残基。基因组水平分析表明,GhEG含5个内含子和6个外显子,而GhGLU无内含子,仅1个外显子。新克隆的2个基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝,而在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝。通过开发SNP标记分别将GhEG和GhGLU在四倍体中的一个拷贝定位在第19染色体和第4染色体上。Q-PCR表达分析表明,GhEG在根、茎、叶中表达水平很低,而在纤维伸长期优势表达,在15 DPA和20 DPA纤维中,该基因在海岛棉海7124中的转录本显著高于陆地棉TM-1。GhGLU在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达,属于组成性表达基因,特别在根、纤维发育初始期和伸长后期优势表达,且表达水平在陆地棉TM-1和海岛棉海7124间也有显著差异。     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析

棉纤维正常发育需要大量的蔗糖供应。转化酶是生物体内蔗糖代谢途径中的关键酶之一, 对转化酶基因的结构和功能研究将有助于揭示复杂的棉纤维发育分子机制, 并为纤维品质改良提供优良的基因资源。本研究以棉纤维突变体im和遗传标准系TM-1纤维发育中显著差异表达的EST序列(GenBank登录号为EY196825)为探针, 通过电子克隆方法, 结合cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆到一个棉花液泡转化酶基因GhVacInv2a (GenBank登录号为KF305322)。该基因ORF全长1857 bp, 编码618个氨基酸, 与已登录的陆地棉GhVacInv2基因(GenBank登录号为FJ864677)序列一致性为99%(E=0)。基因组序列分析表明, GhVacInv2a在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝, 在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝, 其中GhVacInv2a和GhVacInv2分属于A、D亚组同源基因。该同源基因含7个外显子, 6个内含子。Q-PCR分析表明, 该基因在花药中表达量最高, 在快速伸长的纤维组织中优势表达。在13~19 DPA的纤维中, 其在TM-1中的表达水平极显著地高于im突变体。开发SNP标记, 将GhVacInv2a基因定位在异源四倍体棉花第3染色体上。标记与性状的关联分析显示, GhVacInv2a与纤维强度存在显著相关(P=0.0087), 表明GhVacInv2a在棉花纤维品质形成中可能发挥重要功能。     

Genetic effects of nine <Emphasis Type="Italic">Gossypium barbadense</Emphasis> L. chromosome substitution lines in top crosses with five elite Upland cotton <Emphasis Type="Italic">G. hirsutum</Emphasis> L. cultivars

Crosses between Gossypium barbadense L and Gossypium hirsutum L. (Upland cotton) have produced limited success in introgressing fiber quality genes into the latter. Chromosome substitution lines (CSBL) have complete chromosomes or chromosome arms from G. barbadense, line 3-79, substituted for the corresponding chromosome or arms in G. hirsutum in a near isogenic background of TM-1. We top crossed nine CSBL and their parents (TM-1 and 3-79) with five cultivars. Parental lines and their F₂ populations were evaluated in four environments for agronomic and fiber quality traits. The CSBL and their F₂ hybrids showed wide ranges for both agronomic and fiber traits of economic importance. Genetic analysis showed that additive variances were larger than dominance variances for lint percentage, boll weight, lint yield, fiber length, strength, elongation, micronaire, and yellowness; whereas, dominance variances were larger than additive variances only for uniformity of fiber length and equal for fiber reflectance. For all traits, except boll weight and lint yield, significant additive effects of one or more chromosomes from 3-79 in TM-1 background were greater than the corresponding TM-1 chromosome. In addition, we identified specific chromosomes from G. barbadense (3-79) that carry alleles for improvements in specific fiber quality traits in Upland cotton. Favorable additive effects of individual chromosomes or chromosome segments from 3-79 relative to corresponding chromosomes or chromosomes segments from TM-1 were identified in this study as follows: Lint percentage, chromosome/arms 10, 16-15; longer fibers, chromosome/arms 01, 11sh, 26Lo; more uniform fibers, chromosomes/arms 01, 11sh, 10, 17-11; stronger fibers, chromosome/arms 01, 11sh, 12sh, 26Lo, 17-11; fiber elongation, chromosomes/arms 01, 11sh, 26Lo, 10, 17-11; reduced fiber micronaire, chromosome/arms 01, 12sh, 4-15, 16-15, 17-11; fibers with more reflectance, chromosome/arms 10, 4-15, 16-15, 17-11; fiber with less yellowness, chromosome arms 4-15, 17-11. Based on the present study, we concluded that by using CSBL, favorable fiber quality alleles can be introgressed into Upland cotton, thus greatly improving the breeder’s ability for improvement of Upland cotton for a variety of traits. These data should provide useful genetic information to the cotton breeding industry at large.     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

镉胁迫对三个棉花品种(系)产量、纤维品质和生理特性的影响

以抗草甘膦棉花种质系ZD-90和转Bt基因抗虫棉品种s GK3为材料,以陆地棉标准系TM-1为对照,研究了镉(Cd)胁迫下棉花生育期内的植株生长、产量、农艺性状、纤维品质和抗氧化酶系统活性。结果表明,低浓度Cd对棉花植株的生长发育有一定的促进作用;高浓度Cd对植株的生产发育有显著的抑制作用,植株生长量、子棉产量和皮棉产量显著降低。Cd胁迫对棉花单株铃数、铃重和单铃种子数的影响较大,而对衣分无显著影响。不同浓度Cd处理间的棉花纤维品质性状无显著差异。棉花植株体内的抗氧化化物酶(POD、SOD和CAT)活性在棉花生长发育的初期或低浓度胁迫条件下迅速升高,但随着Cd浓度的增大和胁迫时间的延长,酶活性受到抑制。植株体内累积的MDA含量则随着Cd处理浓度的增加和胁迫时间的延长呈逐渐升高趋势。3个品种比较,TM-1对Cd较敏感,ZD-90次之,s GK3受Cd胁迫的为害相对较轻,是一个较耐Cd的棉花品种。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子, 广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1(GenBank登录号: EF651783)。该cDNA序列长1 115 bp, 其开放读码框长度为771 bp, 编码256个氨基酸。表达特征分析表明, 该基因在陆地棉7235不同组织中均表达, 但表达量不同, 特别在开花前1 d, 开花后8 d和11 d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守, 但在非编码区差异较大, 在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝, 推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC₁作图群体, 将GhTF1定位在染色体10上。     

对一个新发现的棉纤维突变体的鉴定及特性分析

在农杆菌介导的转基因组织培养再生后代中发现了一个无绒有絮的纤维发育突变体,通过自交选择T₃代获得其纯合体,命名为CM突变体。尽管CM突变体从转基因后代中发现,但和转基因插入位点无关,推测是在组织培养过程中产生的点突变所致。通过与陆地棉遗传标准系TM-1,海岛棉军海1号,以及新乡小吉无绒有絮(XinFLM),新乡小吉无绒无絮(XinWX),徐州142无绒无絮(XZ142WX),显性光子N1N1,隐性光子n2n2、SL-7-1、MD17及T586等一系列纤维发育突变体分别配制F₂组合进行突变基因的遗传及等位性分析,结果表明CM突变体与纤维发育正常的TM-1和军海1号杂交,F₁表型均为无绒有絮,F₂表现无绒有絮和有绒有絮3∶1分离,说明该突变体与纤维发育正常材料相比,在短绒发育方面存在一个位点的差异,该突变性状由单显性基因控制。等位性测验及分子定位均表明, 控制该突变体短绒的基因与控制N1N1显性光子的N1基因等位。扫描电镜进一步证明该基因突变会造成纤维起始突起延迟。与N1N1突变体相比,CM突变体的衣分比N1N1显著高,而百粒重比N1N1极显著低。推测CM突变体中的突变基因与显性N1基因为复等位基因。