大豆子叶节遗传转化体系优化及抗逆基因AtNHX5的转化研究

以河北省优良大豆品种冀豆15、五星2号和NF-58的子叶节为受体材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化,探讨了影响农杆菌侵染后子叶节不定芽诱导的因素。结果表明:以萌发6 d、4℃处理24 h的子叶节为外植体,农杆菌侵染后经超声波处理30 s、共培养基中添加20 mg·L-1硝酸银,能够提高子叶节丛生芽诱导率,转化植株经草铵膦筛选以及PCR检测,T0代转化率达0.97%。利用该体系对大豆品种五星2号进行At NHX5基因的遗传转化,获得3株T0代RT-PCR检测阳性植株,且2-1号T1代阳性植株检测具有一定耐盐性,初步证明获得了转At NHX5基因的大豆新材料。     

基因枪对大豆进行PSY基因的转化研究

以3个大豆品种的体细胞胚为受体,以PSY为目的基因,应用基因枪法对大豆进行了遗传转化,实验结果表明:不同大豆基因型的体细胞胚对抗性选择标记(Hyg)的敏感性存在极显著差异;高渗处理的培养基加入0.4mol/L甘露醇有利于PSY基因的导入;对已获得10株抗性再生苗,经PCR和PCR-Southern分析鉴定,有4株为阳性,初步证明外源基因PSY已整合到大豆的基因组中.     

大豆子叶节和胚尖再生体系的比较及大豆SR1基因的遗传转化

以合丰23和合丰35的子叶节和胚尖为外植体,通过农杆菌介导对抗大豆疫霉根腐病基因SR1进行遗传转化。结果表明:合丰35胚尖和子叶节体系的出芽率(96.1%和79.1%)均显著高于合丰25(66.45%和74.4%);胚尖转化体系的平均再生周期(40 d)低于子叶节转化体系(68 d);在诱导培养基上培养20 d时胚尖转化体系的转化效率(96.1%)高于子叶节体系(77.8%)。以合丰35胚尖为外植体成功转化大豆抗疫霉根腐病基因SR1,共获得6株转基因植株。     

农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化技术流程及操作要点

大豆遗传转化效率低,是大豆转基因育种亟待解决的重要问题。以大豆子叶节为外植体采用农杆菌介导法,系统地研究了大豆子叶节遗传转化各技术环节的操作要点,包括工程菌液制备、无菌苗获得及外植体制备、农杆菌的侵染及共培养、不定芽诱导、不定芽伸长、根诱导、驯化与移栽、抗性植株的获得及转基因植株的检测等,建立了一套较稳定、高效的大豆子叶节遗传转化体系。并利用该体系,将野生大豆耐盐碱相关基因A1对大豆品种绥农28、合丰50、合丰55、东农50进行遗传转化,系统地探讨了大豆基因型、影响T-DNA的转移效率的各环节、筛选剂浓度及不同基因型转化效率等几个重要因素。     

利用农杆菌介导法将BrCS基因导入大豆的研究

以大豆子叶节作为外植体,通过农杆菌介导法将含有BrCS基因的pCAMBIA3300的双子叶植物表达载体,导入到大豆品种黑农59和黑农53中,并对黑农59遗传转化的影响因素进行了优化,最终获得了抗性植株.经PCR检测和PCR-Southern杂交分析,初步证明了目的基因已整合到大豆的基因组中.     

农杆菌介导的下胚轴法转化大豆研究

以下胚轴为外植体,采用农杆菌介导方法成功将大豆的蓝光受体启动子pGmPLP1导入大豆基因组中,并且该基因在后代中得到稳定遗传表达.比较了栽培品种黑农44用子叶节法和下胚轴法转化的区别,发现用子叶节法不能获得高效转基因植株的品种可以顺利通过下胚轴法进行转化.     

水稻热激蛋白基因HSP90转化大豆的研究

由于干旱和盐碱化的严重影响,我国大豆生产受到很大限制。为了提高大豆的抗旱性,培育抗旱转基因大豆新品种,利用农杆菌介导的子叶节遗传转化技术体系,首次将水稻热激蛋白基因HSP90导入大豆受体材料Bert中,通过HSP90在大豆中过表达,获得了耐旱转基因大豆新材料。本试验中4 000个子叶节外植体用于遗传转化,再生转化苗经PCR和Southern杂交鉴定结合PPT抗性筛选(bar为筛选标记),共获得128棵阳性转基因植株,转化率为3.2%。经初步筛选,获得15份耐旱性较好的材料,其耐旱性显著优于对照。研究结果为进一步筛选耐旱转基因大豆新材料奠定了较好的基础。     

pCAAFP66表达载体的构建及其大豆遗传转化的研究

以pCAMBIA3301为载体骨架,afp为目的基因,构建了大小为9868 bp的大豆表达载体pCAAFP66,该载体带有抗冷冻蛋白基因afp和筛选标记基因bar.以大豆品种华春3号和华春6号的胚尖和子叶节为外植体,应用农杆菌介导法进行遗传转化,以草甘膦(PPT)为筛选底物.结果表明:在胚尖转化体系中,华春3号和华春6...     

利用GUS基因的瞬时表达优化大豆根癌农杆菌介导的遗传转化

高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、切豆方法、侵染时间、共培养方式以及共培养时间等方面对东农47、垦农18和B12088大豆栽培品种的遗传转化体系进行优化。结果表明:东农47萌发1 d,侵染30 min;垦农18和B12088萌发12 h,侵染30 min,GUS基因瞬时表达率最高。在其它的处理上,3个品种表现结果一致,即蘸取菌液切豆,共培养中子叶伤口朝下摆放,黑暗条件下共培养3～5 d,GUS基因瞬时表达最高。3个品种在最适条件下,GUS染色效率均达到90%以上,垦农18遗传转化效率较高。本研究为大豆农杆菌介导子叶节转化方法提供了一个改进的方案,并且为拓宽可利用于大豆遗传转化的种质资源奠定基础。     

MYB转录因子AtPHR1转化大豆研究

以MYB转录因子AtPHR1表达载体为转化对象,采用农杆菌介导子叶节转化技术将其转入栽培大豆,研究不同萌发时间、预培养时间、菌液和侵染液浓度、大豆基因型以及筛选剂浓度对转化效率的影响.结果表明:以萌发5d大豆幼苗制备子叶节外植体,预培养1d,农杆菌菌液OD600为0.7,侵染液OD600为0.5或0.7进行转化,100 mg.L-1卡那霉素进行筛选的抗性芽诱导率最高;5个供试品种中,以五星2号的转化率最高,约为2.0％;经PCR检测转化后的大豆植株,获得了含有转录因子AtPHR1的5个大豆新材料.     

大豆异黄酮合成关键酶基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR法克隆了大豆异黄酮生物合成途径中查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)和查尔酮异构酶(Chalcone Isomerase,CHI)2个关键酶基因,并利用SOE-PCR技术成功将2个基因融合,将其均构建成原核表达载体,在大肠杆菌中进行了初步的表达研究,为进一步研究CHS和CHI 2种关...     

RNA干扰高油GmPEPc基因转入大豆研究

通过构建GmPEPc基因的植物RNAi双元表达载体,并通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将控制油脂和蛋白合成途径的相关基因GmPEPc转入受体品种沈农9号中,通过抑制大豆内源GmPEPc基因的表达,增加油脂积累,从而获得高油的转基因大豆新品种。在大豆组织培养过程中,共切取大豆外植体407块,获得T0代转化苗35株,转化率8.9%。通过对转基因后代中目的基因的整合及表达情况进行分子鉴定。获得23株T_1代转基因后代,其中高抗草丁膦除草剂(喷施浓度300 mg·mL~(-1))14株,通过PCR检测结果表明其中12株为PCR阳性;PCR和Southern杂交检测表明,GmPEPc基因已经成功插入到转基因大豆植株基因组DNA中。对T_1代测定结果显示,转基因大豆籽粒的平均含油量比对照高9.51%,平均蛋白质含量下降5.44%。这些研究结果为筛选高油脂含量的转基因大豆新株系提供了依据,为下一步高油新品种的选育提供了种质基础。     

耐旱基因cspB转化大豆的研究

为提高大豆的耐旱性,本研究根据大豆偏爱的密码子将来源于枯草杆菌抗旱相关基因cspB序列进行了优化,并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-cspB,利用农杆菌介导法将cspB基因导入大豆栽培品种Bert中。用于遗传转化子叶节外植体共3 800个,经PCR和Southern鉴定,并结合PPT抗性筛选,共获得了95棵阳性转基因植株,转化率为2.5%。经初步筛选,获得了7份耐旱性较好的转基因大豆新材料。这些材料将进一步用于耐旱转基因大豆新品种培育工作。     

转录调控基因GmLEC1转化大豆及转化方法的比较

以高油大豆中豆30开花后30 d的发育种子为材料,根据已报道的拟南芥脂肪酸合成相关转录因子LEC1序列设计简并引物,采用同源序列法从大豆种子中分离了大小为850 bp的cDNA片段;采用Gateway技术构建RNAi表达载体pHGlec;分别利用大豆子叶节和胚尖为外植体进行农杆菌介导的遗传转化;以抗性芽获得率,PCR检测阳性率为指标,对转化系统进行优化。确定了6.0 mg.L-1的6-BA为胚尖转化法最佳激素配比;经PCR鉴定,优化后的胚尖转化法阳性苗获得率为7.58%,子叶节转化法转化率为1.86%。     

Ti质粒介导的B、t、k-δ内毒素蛋白基因转化大豆的初步研究

以Ｔｉ质粒为介导，将ｐＫＴ５４Ｂ７Ｃ５质粒上的Ｂ、ｔ、ｋ－δ内毒素蛋白基因导入东北大豆“黑农３７”、“黑农３９”等品种。采用多种外植体和感染方法，从胚轴和子叶节诱导出丛生芽与再生植株。经卡那霉素筛选和冠瘿碱检测，初步证明外源基因导入大豆基因组中。共获得８１株再生植株，其中成活３０株，仅３株结７个荚，得到７粒种子。ＰＣＲ检测和ＤＮＡ分子杂交，鉴定这７株再生植株呈阳性反应，证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。７粒种子均已萌发，植株生长发育正常     

农杆菌介导microRNA398靶基因转化大豆

拟南芥miR398对低磷胁迫有响应。通过生物信息学方法预测找到大豆miR398a的靶基因铜/锌超氧化物歧化酶GmSODC（Copper/zinc superoxide dismutase),通过RT-PCR扩增得到GmSODC全长cDNA,采用LIC（Ligation-Independent cloning）法将GmSODC连接到双元植物表达载体pJG045上,构建成植物表达载体pSDC6。通过农杆菌介导的子叶节法将GmSODC基因导入大豆品种东农50中,获得了转化GmSODC的T1代植株。采用Real-time PCR的方法,对转基因植株进行GmSODC基因转录水平的相对定量分析,其中1株较非转基因植株表达量明显提高。     

Ri质粒介导大豆花叶病毒外壳蛋白基因转化大豆的研究

本文用含有Ｒｉ质粒的发根农杆菌介导，克隆在大肠杆菌ＪＭ１０９中，中间载体质粒ＰＥＳ（具有大豆花叶病毒外壳蛋白基因），通过三亲杂交的方法，将质粒ＰＥＳ导入具Ｒｉ质粒的发根农杆菌（ｐＲｉＡ４ｂ）中，用二元载体法转化黑龙江省常见的大豆品种，合丰２５，黑农３３等品种。用子叶节，胚轴，幼胚和整株感染转化子菌液，诱导出毛状根，经纸电泳检测有２５％左右的毛状根含有冠瘿碱。感染的下胚轴，诱导的毛状根直接形成愈伤组     

大豆子叶节及苗期NaCl筛选试验研究

以NaCl为筛选剂,对5个大豆品种的子叶节诱导、丛生芽生根及大豆苗期的生长情况进行研究.结果表明:不同基因型大豆对NaCl的敏感性不同,同一基因型的不同部位对NaCl的敏感性也存在差异.最终确定了NaCl对子叶节分化、丛生芽生根以及苗期生长适宜的筛选浓度.大豆子叶节分化NaCl临界筛选浓度:吉农27和吉农17为225 ...