鸭肠炎病毒gD基因胞外区的原核表达及在感染鸭胚成纤维细胞中的定位

以本实验室获得的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株US区基因序列(GenBank登录号EU714267)为基础PCR扩增出gD基因胞外区(gDw),将其定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)并转化至大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLys。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明gD基因胞外区在大肠杆菌中获得与预期大小相符的表达蛋白。重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,血清琼扩效价达1∶16,噬斑减数中和试验测定血清中和抗体效价达1∶64。通过免疫荧光技术首次对gD进行亚细胞定位检测,结果表明DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后4h近核区域细胞质内首先开始出现荧光,12h以后显著增加,明显的点状绿色荧光广泛存在于胞质中。本研究为进一步开展DEV gD的功能研究提供了重要数据和材料。     

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株在鸭胚成纤维细胞中形态发生学的研究

采用超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株（DEV-CHv）在鸭胚成纤维细胞（DEF）中的形态发生学进行了研究。结果表明，DEV-CHv吸附到DEF细胞上以后通过囊膜和细胞膜间发生融合的方式侵入宿主细胞；病毒在细胞核内完成病毒核酸的生成、核酸与衣壳的装配；病毒核衣壳通过核膜-内质网膜系统从细胞核转运到内质网池中并在内质网池中得到皮层结构；获得了皮层的DEV-CHv核衣壳通过出芽方式释放到细胞空泡内得到囊膜结构后成为成熟病毒；细胞空泡内的成熟DEV-CHv可通过细胞的胞吐作用被释放到细胞外，或在空泡破裂时被释放到细胞外。     

鸭病毒性肠炎病毒致鸭胚成纤维细胞发生凋亡作用的研究

研究通过HE染色镜检发现,鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)可致鸭胚成纤维细胞(DEF)出现染色质颗粒化、细胞核变形等显著凋亡特征;TUNEL试验显示,接毒组细胞核内有多量棕黄色DAB显色颗粒,表明细胞出现了凋亡现象;DNA Ladder检测表明,接毒组细胞具有分子量分别为180～200bp及其整数倍的凋亡梯带电泳图谱特征;电镜观察发现,接毒组细胞具有染色质浓缩、边移,胞浆严重空泡化,细胞核严重变形,形成凋亡小体等典型凋亡特征.上述研究结果表明鸭病毒性肠炎病毒具有显著的致鸭胚成纤维细胞发生凋亡的作用.     

应用PCR检测鸭肠炎病毒弱毒在鸡胚体内的分布

根据GenBank已发表的鸭肠炎病毒（DEV）UL6基因的部分核苷酸序列，设计并合成一对引物．以鸭肠炎病毒中国商品化疫苗毒蚀斑纯化株（DEV Clone-03）DNA为模板，经PCR扩增出预期516bp的目的片段。将此片段插入克隆载体质粒pMD18-T，并进行序列测定，序列比较结果显示，此段序列与参考序列完全一致。用PCR检测DEV Clone-03在鸡胚体内的分布情况显示，接毒死亡鸡胚的尿囊膜、心、肝、脾、肺、肾和肌肉皮肤内均存在病毒。PCR敏感试验表明此方法可以检测到100μL尿囊液中提取的10^-3稀释的病毒DNA，相当于0．2个EID50病毒量的DNA。     

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株适应在鸭胚成纤维细胞上生长的研究

对分离自鸭体的鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)进行了适应在鸭胚成纤维细胞(DEF)上生长的研究。结果表明,DEV-CHv病死鸭肝脏悬液以绒毛尿囊腔途径经10日龄鸭胚连续传代2次,取尿囊液接种细胞的方法可获得适应DEF生长的DEV-CHv,而肝组织内病毒直接接种在DEF上则不生长。DEV-CHv刚适应DEF时以细胞变圆、折光度增强为病变特征,而适应DEF后以细胞脱落和形成圆形蚀斑为特征。适应DEF的DEV-CHv通常30h左右使细胞脱落,36h左右在细胞单层上形成蚀斑,48h时细胞病变可达80%以上。     

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构观察

通过超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒（DEV）CH强毒株在鸭胚成纤维细胞（DEF）中的形态结构进行了研究。结果发现，DEVCH强毒株病毒核酸呈圆形颗粒状，直径35～45nm，在胞核内常集中分布；病毒核衣壳呈圆形．直径90～100nm．在胞核和胞浆内都有分布；DEV核衣壳可根据所含核酸形态的差异分为空心核衣壳、内壁附有颗粒型核衣壳、同心圆形核衣壳和实心核衣壳；成熟的病毒粒子具有囊膜和皮层结构．呈圆形．直径150～300nm，存在于胞浆空泡内；DEV可在DEF中分别形成胞浆内和胞核内包涵体结构；伴随子代病毒在细胞内的出现，胞浆内迁出现豆英状、马蹄形、半圆形、圆形、同心圆形等与病毒发生有关的电子致密结构。     

鸭肠炎病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

设计一对特异性引物扩增出鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因,并将其定向插入到原核表达载体pET32a上,构建了NP基因的原核表达载体pET-NP;将重组载体pET-NP转化表达宿主菌BL21后,经SDS-PAGE分离后行Western blot显示,获得的表达产物具有良好的免疫原性;应用His.Bind亲和层析柱纯化重组NP蛋白,并以此作为包被抗原,初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的iNP-ELISA;经方阵滴定确定,重组蛋白抗原的最佳包被浓度为5.0μg/L,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判定标准为:待检血清OD405值≥1.2,且待检血清OD405和阴性血清OD405的比值≥2.0;应用iNP-ELISA对450份鸭血清样本进行检测,结果iNP-ELISA与全病毒包被的iDEV-ELISA符合率达90.9%。     

鸭肠炎病毒SORF3基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增获得SORF3(S3)基因,在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLys系统中原核表达。S3重组蛋白经IPTG诱导,SDS-PAGE分析显示外源基因以包涵体形式表达为主,分子质量约为52ku。重组蛋白经Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,琼脂扩散法测得抗体效价为1:4。经Western blotting分析制备的多克隆抗体具有较高的特异性,间接免疫荧光试验证实制备的多克隆抗体与DEV的SORF3编码产物反应性良好,为进一步研究DEVSORF3结构与功能特性奠定了基础。     

鸭肠炎病毒囊膜糖蛋白gE基因序列分析及真核表达载体的构建

为探索鸭肠炎病毒（DEV）囊膜糖蛋白gE基因的相关特性和功能,应用PCR扩增了DEV的gE基因,全长1473bp,编码490个氨基酸,其中1～22位氨基酸为信号肽。gE基因与国内分离强毒CHv株、国内疫苗株同源性均为100％,与德国分离强毒2085株同源性达到99％,显示其高度保守。将gE基因完整开放阅读框（gE）和去信号肽的gE基因（gE’）分别克隆至真核表达载体pCDNA3．1．获得重组质粒pCDNA3．1-gE、pCDNA3．1-gE,然后应用脂质体法转染vero细胞。RT—PCR扩增证实gE、gE’均在细胞内进行了转录,而间接免疫荧光试验证实只有gE’基因在veto细胞中获得了表达,h研究gE蛋白的功能及研制鸭瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。     

雏鹅新型病毒性肠炎病毒对鸭胚成纤维细胞的适应性及增殖特性

为了获得适宜雏鹅新型病毒性肠炎病毒（NGVEV）体外培养的细胞系，开展了NGVEV强毒株在鸭胚成纤维细胞（DEF）适应性和增殖特性的研究。结果表明，NGVEV强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚传4代，取尿囊液接种DEF，第1代无明显细胞病变；第2代培养至72～96hDEF出现颗粒状缺失、脱落，但无典型蚀斑出现；第3代培养至96～120h，DEF形成大小不等、圆形或椭圆形的典型蚀斑；第5代以后的NGVEV可稳定适应于DEF，典型细胞病变出现于48～72h。取适应DEF的NGVEV感染DEF细胞后制作超薄切片经电镜观察，可见典型的腺病毒粒子，大小为70～90nm。NGVEV在DEF上的TCID5。值随着传代次数增加而增高，由第1代的10^1.23增加到第8代的10^8.02，最高毒价出现于96～144h，96～120h是收获病毒的最佳时间。     

鸭病毒性肠炎gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

利用DNAStar分析并筛选出鸭病毒性肠炎病毒gB基因的两段主要抗原区域,PCR扩增出这两段主要抗原区域并克隆进入载体pMD18-TVector,目的基因经PCR和酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a(+)。获得的重组质粒分别转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-bloting及免疫鼠血清ELISA抗体检测结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。     

鸭病毒性肠炎病毒基因组异构体的研究

为研究鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因组异构体的存在形式,本研究在已建立的以pCC1FOS为载体的DEV疫苗株基因文库基础上对DEV全序列进行了测定,并进一步对DEV基因组的异构体进行了研究。对261个重组fosmid中的DEV基因组片段的末端序列进行测序及序列分析,初步证明了DEV基因组有3种异构体,即P型、IS型和ILS型,未发现IL型的存在。并且,以上3种异构体在基因组中所占比例分别为77.1%、8.6%和14.3%。通过对11个重组fosmid的全序列测定,进一步确认了以上3种异构体的存在。该结果为DEV的分类提供了重要实验依据。     

Cloning and sequence analysis of US1 gene in duck enteritis virus

In this paper,a 1,860 bp sequence in IRs region of duck enteritis virus(DEV) was amplified by single oligonucleotide nested PCR with a single primer designed according to partial sequence of US1 and then a pair of primers designed according to the 3' UTR of US8 gene and 5' end of the new getting sequence were used to amplify a 2,426 bp sequence toward the TRs region.Sequence analysis revealed that the both sequences contained an identical 990 bp open reading frame of DEV US1 gene.The two ORFs were in opposi...     

Molecular characterization of duck enteritis virus CHv strain UL49.5 protein and its colocalization with glycoprotein M

The UL49.5 gene of most herpesviruses is conserved and encodes glycoprotein N. However, the UL49.5 protein of duck enteritis virus (DEV) (pUL49.5) has not been reported. In the current study, the DEV pUL49.5 gene was first subjected to molecular characterization. To verify the predicted intracellular localization of gene expression, the recombinant plasmid pEGFP-C1/pUL49.5 was constructed and used to transfect duck embryo fibroblasts. Next, the recombinant plasmid pDsRed1-N1/glycoprotein M (gM) was produced and used for co-transfection with the pEGFP-C1/pUL49.5 plasmid to determine whether DEV pUL49.5 and gM (a conserved protein in herpesviruses) colocalize. DEV pUL49.5 was thought to be an envelope glycoprotein with a signal peptide and two transmembrane domains. This protein was also predicted to localize in the cytoplasm and endoplasmic reticulum with a probability of 66.7%. Images taken by a fluorescence microscope at different time points revealed that the DEV pUL49.5 and gM proteins were both expressed in the cytoplasm. Overlap of the two different fluorescence signals appeared 12 h after transfection and continued to persist until the end of the experiment. These data indicate a possible interaction between DEV pUL49.5 and gM.     

应用单克隆抗体的免疫组织化学法研究雏鸭体内鸭瘟病毒的分布

本实验应用了免疫组织化学的单克隆抗体间接酶标染色法，对人工感染鸭瘟病毒雏鸭的组织切片进行染色观察。旨在研究病毒在鸭体内分布，对其进行定位。研究结果显示，鸭的心脏、肝脏、脾、胸腺、肠、法氏囊、胰、肺、肾等组织的细胞浆内均出现了染色的特异阳性反应物。结果表明，鸭瘟病毒广泛分布于感染雏鸭的各种组织器官，并造成一定的组织病理变化。     

复方中药“禽康散”对鸭瘟病毒感染鸭胚及成纤维细胞的保护效应

将不同浓度复方中药“禽康散”和鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)分别以不同方式接种到鸭胚尿囊膜后观察其对DPV感染的鸭胚保护率;用MTT法测定“禽康散”对鸭胚成纤维细胞(DEF)的安全质量浓度和增殖的影响,及安全质量浓度范围内的“禽康散”对DPV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)能力的影响.结果显示,“禽康散”在10日龄鸭胚内对DPV具有显著的杀灭和阻断感染的作用.“禽康散”对DEF的最大安全质量浓度为2-4 g/mL,在2-4～2-8 g/mL质量浓度范围内对DEF有显著的增殖和抑制DPV感染DEF的能力,且与加药方式和药物质量浓度有一定关系.结果表明,一定质量浓度的“禽康散”对DEF具有增殖作用,并对DPV在鸭胚内和细胞水平上均有较好的杀灭和拮抗作用.