大雁生殖系统的解剖学和组织学研究

实验对生殖季节与非生殖季节的大雁生殖系统进行了组织学研究。大雁雌性生殖系统左侧发育，右侧退化。生殖系统由卵巢、输卵管、交际器组成。输卵管包括漏斗部、蛋白分泌部、峡部、子宫与阴道五个部分。卵巢表面无浆膜覆盖，覆以单层生殖上皮，由浅部的皮质和深部髓质组成，皮质内含各级卵泡。雄性生殖系统由精巢、输精管、睾丸旁导管系统和交接器组成。精巢的基本结构单位为曲精细管，外层包被着浆膜，其下是白膜，白膜结缔组织伸入精巢实质部，呈网状分布，繁殖季节的睾丸实质内充满曲细精管。     

产蛋期皖西白鹅生殖系统的形态学观察

研究采用大体解剖法、石蜡切片法、HE染色法等对20只产蛋期的皖西白鹅母鹅生殖系统的形态结构和组织结构进行了观察,结果如下:皖西白鹅母鹅的生殖系统包括卵巢和输卵管两部分,仅左侧发育正常,右侧早已退化,卵巢表面被覆生殖上皮,下方是白膜,其实质由皮质和髓质组成,皮质内含有不同发育阶段的卵泡和萎缩卵泡,大卵泡突出了卵巢表面,卵泡无卵泡腔,也无卵泡液,排卵后不形成黄体。输卵管分为漏斗部、蛋白分泌部、峡部、子宫部和阴道部5个部分,各段均由黏膜层、肌层和外膜构成,黏膜上皮有纤毛,固有层内有腺体和淋巴组织,无黏膜肌层,肌层由内环外纵两层平滑肌组成,外膜为浆膜。     

诱导发情后母犬生殖器官组织学及组织化学观察

为了进一步探讨犬的生殖生理学,试验以诱导发情后母犬生殖器官为试验材料,采用组织学和组织化学技术,观察了诱导发情后母犬卵巢、输卵管和子宫的形态学特点。结果表明:诱导发情后犬卵巢外观呈葡萄串状,镜下可见大量黄体、少量原始卵泡和初级卵泡;诱导发情后母犬输卵管壁由黏膜层、肌层和外膜构成,黏膜上皮主要是由纤毛上皮细胞、分泌细胞构成的单层柱状上皮,黏膜固有层可见由纤毛上皮和分泌细胞围绕形成的管状腺,PAS反应可见分泌细胞的游离面和管状腺内有少量的阳性物质;诱导发情后母犬子宫壁由黏膜、肌层和外膜构成,黏膜上皮是单层柱状上皮,黏膜固有层内可见由单层柱状上皮构成发达的管状腺,子宫黏膜上皮细胞内含有少量PAS阳性物质,表面覆盖一层PAS阳性物质,而腺腔内含大量PAS阳性物质。     

大鸨生殖系统形态结构初步研究

通过对7只不同年龄♂♀体大鸨生殖系统的形态结构解剖发现：大鸨雄性生殖系统由睾丸、附睾、输精管和交配器组成,无真正的阴茎,而具有阴茎体。睾丸一对,黑色、长形、豆状,右侧在前,左侧睾丸略大于右侧。大鸨睾丸从孵化出壳到性成熟无颜色变化,只是体积和重量增长。附睾在幼年时不明显,而在成体发情期时显著,呈前端较大的纺锤形。输精管外观为半透明、黑色弯曲的线状,沿输尿管向后延伸至泄殖腔壁形成突起,即输精管乳头;雌性生殖系统由卵巢和输卵管组成。卵巢和输卵管仅左侧正常发育,右侧输卵管退化为—短白色盲管。左卵巢因卵泡发育而呈葡萄串状。左输卵管在性未成熟时为一直形细管,性发育成熟后有较多弯曲,管径也增大,可分为漏斗部、壶腹部、峡部、子宫和阴道5部分。     

雌性中华鳖输卵管精子储存结构的研究

应用光镜和电镜技术,系统观察雌性中华鳖输卵管精子储存情况,显示与精子储存有关组织结构与细胞形态。结果表明,精子储存在雌性中华鳖输卵管的蛋白分泌部后部至子宫部,但各段的组织结构及精子储存量存在一定差别。蛋白分泌部后部上皮较发达,由典型的高柱状纤毛细胞和分泌细胞构成,固有膜中腺体多为泡状腺。上皮和腺体中含有大量高密度的膜性分泌颗粒,此段只有少量的精子储存。峡部较窄且固有膜内无腺体,上皮排列紧密并呈迷路样迂回分布,上皮细胞内高电子密度分泌颗粒成团集中分布在核上方。峡部管腔中分布着大量的精子,靠近管腔的精子或精子头部嵌入上皮纤毛之间或顶端凹陷的胞质中,且精子嵌入部分的细胞结构保持完整。子宫前部形成垂直于管腔的储精小管(SST),子宫上皮及此段SST上皮的分泌颗粒电子密度不均,含高密度电子致密斑,腺体中的分泌颗粒也呈现不同的内部结构。子宫部及SST的管腔中储存有大量精子。这些区段复杂的细胞结构及分泌活动,可能在精子储存中发挥重要作用。     

禽腺病毒人工感染产蛋鸡生殖器官的超微结构观察

采用两株禽腺病毒ＥＤＳ７６Ｈ９１－１和ＥＤＳ７６Ｙ８１Ｇ４人工感染８只ＳＰＦ产蛋鸡和３２只伊莎蛋鸡，第４天后蛋壳颜色变浅，并出现软壳蛋、薄壳蛋、畸形蛋等。在感染后第３至２０天内不同时期分别扑杀，取卵巢和输卵管进行电子显微镜观察发现：卵巢的细胞及核异常，输卵管粘膜上皮的分泌细胞和纤毛细胞严重病变。其结果证实了病毒主要侵害了鸡的生殖道。     

鸭黄病毒SDbz株的分离与初步鉴定

鸭黄病毒病为近年来新发的鸭病,给养鸭业带来了极大的经济损失。为了深入研究本病的防制,本试验对鸭黄病毒(duck flavivirus,DFV)进行了分离鉴定。取疑似感染DFV的病鸭病料,经细菌分离初步排除细菌感染后,应用RT-PCR检测呈现DFV阳性,处理后将其接种到鸭胚成纤维细胞(DEF)和健康鸭胚上进行病毒分离传代。结果显示,在DEF细胞上第1代48 h就开始出现CPE,随着时间的延长CPE更加明显,通常在72~96 h产生典型CPE;接种鸭胚每一代均出现死亡,且死亡时间多集中于接种后60~72 h,死亡鸭胚胚体水肿、出血、发育不良、胚肝严重出血、肿胀或斑驳样坏死等病变。将病毒DEF细胞和鸭胚分离物应用血凝试验、毒价测定、病毒中和试验、RT-PCR及人工感染试验进行检测鉴定,证明所分离到的病毒为DFV,并将其命名为DFV SDbz株。     

贵州省鸭源新城疫病毒强毒株的遗传变异分析及致病性研究

为了科学理解家鸭在新城疫病毒(NDV)流行和传播中的作用,对贵州不同地区分离的5株鸭源NDV强毒株进行遗传变异分析以及对鸭和SPF鸡的致病性研究。结果显示:5株NDV分离株均属于基因Ⅶd亚型,其F蛋白裂解位点基序均为112 RRQKRF117,符合强毒株序列特征,与病毒致病性指数测定结果相符;F和HN蛋白中功能性氨基酸位点均高度保守,但在HN蛋白线性表位区有3株发生E347K突变。交叉血凝抑制试验发现分离株与传统疫苗株LaSota的抗原同源性较低(为83.3%~87.0%),而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性较高(为93.5%~100%)。将5株NDV分离株以0.5mL病毒尿囊液原液通过肌肉注射感染鸭后未见明显发病死亡和病理变化,并且除脾外在其他多个组织脏器未能检测到病毒复制;而以106.0 ELD50·0.1mL-1剂量通过滴鼻点眼感染SPF鸡后6d内100%发病死亡,病死鸡表现出新城疫典型的临床症状和病理变化,病毒在多个组织脏器中均能复制且对脾、胸腺和法氏囊等免疫器官损伤严重。另外,SPF鸡攻毒后喉头和泄殖腔棉拭病毒分离率明显高于试验鸭。本研究结果表明,贵州省鸭群中流行的基因Ⅶd亚型NDV强毒株HN蛋白发生E347K突变的变异株呈上升趋势,并与传统疫苗株产生抗原差异;5株鸭源NDV强毒株对鸭和鸡致病性差异显著,虽然对鸭无明显致病性,但鸭感染后可在较长时间内通过喉头或泄殖腔向体外排毒,因此必须采取有效措施防止NDV强毒由鸭群向鸡群的传播。     

黄牛输卵管结构的组织学观察

采用冰冻切片HE染色方法对黄牛输卵管各部进行了组织学观察，以为生殖生理学和胚胎工程学等教学和研究工作提供基础资料。结果显示，黄牛输卵管伞和漏斗部为膜性结构，由两侧的假复层纤毛柱状上皮和中央的疏松结缔组织共同构成，没有肌层和外膜。壶腹部和峡部均由黏膜层、肌层和外膜构成。黏膜上皮为假复层纤毛柱状上皮，由柱状纤毛细胞、分泌细胞和基细胞共同构成，固有膜由疏松结缔组织构成，在峡部尚含有浆液性腺泡。黏膜层形成大小不等的初级纵行皱褶。漏斗部和壶腹部的大初级皱褶又分出数量不等的次级皱褶和三级皱褶；峡部只有初级皱褶，无次级皱褶和三级皱褶。肌肉层由内斜、外环两层平滑肌构成。外膜大部分为浆膜结构，在输卵管系膜侧为结缔组织的外膜。     

促凋亡基因(Bad)在卵泡期绵羊生殖器官中的表达

以卵泡期小尾寒羊和萨福克羊为研究对象,采用免疫组织化学技术,对促凋亡基因(Bad)在生殖器官卵巢、输卵管和子宫中的表达与定位进行初步研究。结果表明,在卵巢组织中Bad基因在原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡中呈中度着染,在三级卵泡中呈轻度着染,阳性细胞在卵泡上皮细胞和颗粒细胞中分散分布,呈轻度着染;输卵管上皮分泌细胞和部分纤毛细胞胞质中见Bad基因中等强度表达,输卵管壶腹部上皮中,Bad基因多表达于分泌细胞,纤毛细胞中有部分呈阳性且强度弱,宫管结合部、峡部和壶腹部Bad基因阳性细胞染色强度弱,均呈中度着染;子宫内膜子叶和基质中的阳性细胞数量极少,阳性细胞呈轻度着色。利用计算机图像分析技术测量小尾寒羊和萨福克羊生殖器官各组织细胞中Bad基因表达的阳性细胞率和平均光密度,结果Bad基因在这2品种绵羊组织中的表达规律大体相似,但也存在一些明显的差异:萨福克羊三级卵泡颗粒细胞Bad基因阳性细胞率显著高于小尾寒羊(P0.01);萨福克羊三级卵泡和成熟卵泡膜细胞Bad基因阳性细胞率和平均光密度均显著高于小尾寒羊(P0.01);萨福克羊子宫内膜腺体卵泡期Bad基因阳性细胞平均光密度显著高于小尾寒羊(P0.01);由此表明,小尾寒羊和萨福克羊卵泡期生殖器官中细胞凋亡的差异与Bad基因表达的差异,可能是造成两者繁殖力高低差异的基础。     

人工感染鸭源新城疫病毒对绍鸭β-防御素和细胞因子基因表达的影响

试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）对绍鸭β-防御素（avian β-defensins,AvBDs）和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组（27只）和对照组（18只）,攻毒组采用滴鼻点眼的途径（10^8.38 EID₅₀）接种鸭源NDV强毒株（Md/CH/LGD/1/2005）,对照组接种磷酸盐缓冲液。在攻毒后24和48 h,从对照组及攻毒组各随机取6只鸭屠宰,分别采集肾脏、肺脏、气管、腺胃、骨髓、脾脏、盲肠扁桃体、哈德氏腺、法氏囊9个组织,运用实时荧光定量PCR法检测组织样品中9种AvBDs和细胞因子的表达量;剩余鸭每天持续观察,每隔4 d采血1次,直至24 d,检测血清抗体水平;于攻毒后24、48、72和120 h采集咽喉及泄殖腔拭子,以确定排毒周期。结果表明,感染该NDV毒株后,鸭没有临床发病症状和死亡情况发生;感染后鸭排毒开始于攻毒后第1天,到第5天停止,在攻毒组咽喉及泄殖腔拭子中均检测到NDV。抗体水平检测结果显示,该NDV能够诱导鸭体内产生抗NDV特异抗体。实时荧光定量PCR结果发现,与对照组相比,感染后24 h,部分鸭组织中AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD6、AvBD9和AvBD16表达量均显著升高（P<0.05）;感染后48 h,AvBD1和AvBD6在部分鸭组织中表达量均显著上调（P<0.05）;感染后48 h法氏囊中白细胞介素6（IL-6）和脾脏中干扰素γ（IFN-γ）的表达量明显低于感染后24 h的表达量。综上所述,该鸭源NDV毒株感染可诱导绍鸭体内在早期产生天然免疫反应,这些反应可能与病毒在机体内复制有关。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

Contribution of mutation I142M in fusion protein and Q44R in matrix protein of Newcastle disease virus to virulence in ducks

Although verogenic Newcastle disease viruses (NDVs) generally cause subclinical infection in waterfowls such as ducks, NDVs with high virulence in waterfowl have been sporadically reported. We previously reported that the NDV d5a20b strain, which is obtained by serial passaging of the velogenic 9a5b strain in domestic ducks, showed increased virulence in ducks (Hidaka et al., 2021). The d5a20b strain had 11 amino acid substitutions in its P/V, M, F, HN, and L proteins as compared to 9a5b. In the present study, we generated a series of recombinant (r) NDVs with these amino acid substitutions to identify the molecular basis of virulence of NDV in ducks, and evaluated their influences on virulence and in vitro viral properties. Each of the single amino acid substitutions in either the F protein I142M or the M protein Q44R contributed to the enhancement of intracerebral and intranasal pathogenicity in domestic ducks. The cell-cell fusion activity of the virus with F I142M was five times higher than that of the parental r9a5b. The virus with M Q44R rapidly replicated in duck embryo fibroblasts. Additionally, the rM+F+HN strain, which has the same amino acid sequences as d5a20b in M, F, and HN proteins, showed the highest level of virulence and replication efficiency among the generated recombinant viruses, nearly comparable to rd5a20b. These results suggest that multiple factors are involved in the high growth ability of NDV in duck cells, leading to increased virulence in vivo.     

鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16 fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。     

一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒(简称NDV-104),对其生物学特性、致病性和融合蛋白(fusion,F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点(112~117位)的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。     

鸭副粘病毒强毒株的分离和鉴定

采用鸡胚接种法从安徽凤阳某患病肉鸭群中分离到一株病毒。该素株对鸡红细胞具有凝集性，并可被康复鸭鸭血清和NDV阳性抗血清所抑制，而不能被禽流感标准阳性血清抑制，结合血清中和鸡胚接种试验，病毒回归试验和免疫防治效果的研究结果，确认为鸭副粘病毒。参照国际上规定的新城疫病毒毒力判定的标准及其方法，测定该分离株的鸡胚最小致死量平均死亡时间（MDT），1日龄鸡及脑内接种致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉内接种致病指数（IVPI）分别为48.9h,1.80和2．45。表明该鸭副粘病天线离株具有新城疫病毒（NDV）速发型相类似的毒力，属强毒力毒株，并定名为WF00D株。     

DP1/02株鸭源Ⅰ型副黏病毒F基因真核质粒构建及免疫试验

应用RT-PCR方法从鸭源Ⅰ型副黏病毒DP1/02株中扩增F基因并克隆入pMD18-T载体,经序列测定、分析,DP1/02株F基因与鸡新城疫病毒（NDV）国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%。随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,将阳性质粒体外转染Vero细胞,通过间接免疫荧光对真核质粒的表达进行鉴定,利用pCI-F质粒进行动物试验。结果表明构建的真核表达质粒pCI-F能够在Vero细胞中表达,雏鸭免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,二次免疫雏鸭后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%。本试验为利用F基因构建的核酸疫苗提供了重要的技术支持。     

Characterization of Newcastle Disease Viruses Isolated from Chickens and Ducks in Tamilnadu,India

During 1993, outbreaks of Newcastle disease occurred on many farms in Tamilnadu, India. Six Newcastle disease virus (NDV) isolates were obtained from the chickens on five different farms and from the birds on one duck farm during outbreaks of the disease. All the isolates were characterized as velogenic, based on the mean death time, intravenous pathogenicity index, intracerebral pathogenicity index (ICPI), stability of haemagglutinin at 56°C, agglutination of equine erythrocytes, haemagglutination elution pattern and adsorption of haemagglutinin by chick brain cells. The isolate obtained from ducks resembled a group D strain, based on its ICPI and its reaction with a panel of monoclonal antibodies. The other five NDV isolates obtained from chickens were placed in groups B(1), C1(2) and D(2) on the basis of their binding patterns with the panel of monoclonal antibodies. In challenge experiments, it was found that LaSota vaccine provided 100% protection against each of these field isolates and against a local NDV strain obtained from the Institute of Veterinary Preventive Medicine, Tamilnadu, India, while unvaccinated chickens succumbed to challenge. The possible origin of epizootic viruses causing outbreaks in vaccinated flocks is discussed.     

Molecular epidemiological investigation of Newcastle disease virus from domestic ducks in Korea

To expand the epidemiological understanding of Newcastle disease virus (NDV) found in domestic ducks in Korea, 14 NDV isolates from apparently healthy domestic ducks were biologically and genetically characterized. Thirteen and 1 isolates of NDV were categorized into lentogenic and velogenic viruses, respectively, based on in vivo pathogenicity tests. Twelve lentogenic viruses showed HA activity to horse RBCs, while 1 lentogenic virus and the velogenic virus were negative. Lentogenic viruses (n=13) had sequence motifs of (112)ERQERL(117) (n=1) or (112)GRQGRL(117) (n=12) at the F0 cleavage site, while the velogenic virus (n=1) had a sequence motif of (112)RRQKRF(117) at the same site. Phylogenetic analysis revealed that at least three distinct genotypes may exist in domestic ducks in Korea; one class I genotype (genotype 2), and two class II (genotypes I and VII) genotypes. The class I virus was most closely related to strains of genotype 2 which were isolated in birds from the USA, Germany and Denmark. Twelve lentogenic class II viruses were grouped together in genotype I, and were then divided into at least three clusters, namely Aomori-like, Ulster2C-like, and V4-like. The velogenic class II virus was assigned to genotype VII which represents viruses responsible for recent epidemics in many Asian countries including Korea. The epidemiological importance of domestic duck isolates of NDV in Korea is discussed.     

一株鸭源新城疫病毒强毒株的分离与初步鉴定

从表现腹泻、神经症状、肠道粘膜局部出血、坏死以及卵泡充血、出血为特征的病死产蛋鸭分离到一株病毒,经血凝（hemagglutinin,HA）、血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）和血清中和试验（seium neutralization,SN）及部分融合蛋白（F）基因的序列测定初步鉴定为新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）,命名为JSD0812株。该毒株10日龄SPF鸡胚平均死亡时间（mean deathtime,MDT）为54．6h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数（intracerebral pathogenicity index,ICPI）为1．75,6周龄SPF鸡静脉接种指数（intravenous pathogenicity index,IvPI）为2．68,其F蛋白裂解位点氨基酸序列为^112R—R—Q—K—R—F^117,上述结果符合NDV强毒株的分子特征,证实该毒株为NDV强毒株。致病性试验表明该毒株对鸡、鸭和鹅均有很强的致病性．