大豆愈伤原生质体的制备和培养方式探究

具有植物细胞全能性的原生质体是探究植物遗传转化和基因功能的理想材料,为了高效率制备大豆原生质体及其稳定培养,以交大05-133大豆未成熟子叶诱导的愈伤组织为材料,采用正交设计,对纤维素酶、果胶酶和离析酶等酶解液成分进行分析,研究原生质体高效制备方法的酶解液配比,同时探讨不同酶解时间对原生质体产量的影响,以确定最佳的原生质体酶解条件;通过对比在低熔点琼脂固体液滴培养与液体培养这两种不同培养方式下细胞的增值速率,以期建立高效的愈伤原生质体再生体系。结果显示,最佳酶解液配比为:2%纤维素酶+0. 1%果胶酶+1%离析酶,在该酶解液配比下酶解5 h,所得到原生质体产量和活力最高,达到(3. 976±0. 86)×10~6个·g~(-1)。用KP8培养基对原生质体进行培养,结果显示固体液滴的培养方式更适合原生质体的分裂,原生质体植板率高于液体培养,并且在25 d内分裂形成致密的细胞团。     

咖啡叶片原生质体分离条件的研究

以中粒种咖啡（Coffea. canephora）叶片组织为材料,研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透压及预处理措施对其原生质体分离效果的影响,以期确定能够酶解出高数量且高活力的原生质体的酶解条件。结果表明：获得有活力原生质体的最佳酶液组合为2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.3％离析酶,同时酶解时间为20 h、酶液渗透压即甘露醇浓度为0.7 mol/L,预处理措施为黑暗24 h的咖啡叶片组织得到8.1×105个/g、活力达到73％的原生质体。     

毛叶枣与冬枣原生质体分离体系的建立

研究了毛叶枣及冬枣的原生质体分离条件,为以后应用体细胞融合技术创造优异的毛叶枣体细胞杂种材料提供技术支持。结果表明:枣叶片分离出的原生质体活性显著高于悬浮培养物,但是产量低于悬浮培养物分离出的原生质体。毛叶枣酶解所需酶液最佳浓度为纤维素酶10g/L 离析酶4g/L 甘露醇0.7mol/L;冬枣酶解所需酶液最佳浓度为纤维素酶15g/L 离析酶4g/L 甘露醇0.7mol/L,酶解时间均为14￣16h。     

番木瓜种子原生质体制备技术的研究

以番木瓜（Carica papaya L.）成熟种子为材料,通过正交和单因素实验研究不同酶液浓度、甘露醇浓度、酶解时间、酶解pH等因素对番木瓜种子原生质体分离的影响。结果表明,高存活的番木瓜种子原生质体分离最佳条件是酶液组成为2.2％纤维素酶+0.6％离析酶、甘露醇浓度为0.7 mol/L、酶解9 h、酶解pH值为5.5。本研究奠定了原生质体遗传转化的基础,为番木瓜种子相关活性物质代谢途径的研究创造了良好的条件。     

播娘蒿与甘蓝型油菜的原生质体融合与植株再生

以播娘蒿叶片和甘蓝型油菜子叶为材料提取原生质体.采用PEG-高pH、高钙附加DMSO融合方法,液体浅层静置培养,研究影响播娘蒿与甘蓝型油菜原生质体融合的因素,获得了再生植株.结果表明:4%纤维素酶 0.5%离析酶 5mmol/L MES酶解10b可获得高产率播娘蒿原生质体,1%纤维素酶 0.2%离析酶 3mmol/LMES酶解14h可获得高产率油菜原生质体;30%PEG 0.3mol/L葡萄糖 50mmoL/L CaCl2·2H2O 15%DMSO可获得10%的融合率;改良B5培养基的原生质体培养效果最好;最佳分化培养基为MS 4.0mg/L 6-BA 0.3mg/LNAA 5.0mg/L AgNO3;最佳生根培养基为MS 0.1mg/LIBA 0.1mg/L NAA.     

橡胶树PR107原生质体的分离和培养研究

以橡胶树PR107花药愈伤组织建立的胚性悬浮细胞为材料,进行原生质体的酶解分离和培养研究。结果表明：在酶组合为纤维素酶1.5 %+果胶酶0.15 %+离析酶0.5 %的酶解处理下,继代培养第6天、直径小于0.5 mm悬浮细胞团获得最高产量的原生质体,达到2.2×107个/mL PCV;原生质体在看护培养基上培养1周后观察到细胞开始发生分裂,培养2周后细胞分裂形成含8-10个细胞的小细胞团。看护培养45 d后原生质体持续分裂并发育成肉眼可见的小愈伤组织。     

无糖培养条件下三种大豆组培苗生长差异研究

在可控环境下,以有糖培养为对照,对中黄13、中黄25和鑫豆1号三个大豆品种进行了无糖培养试验,探讨了三个品种的组培苗的生长差异和根系活力差异.结果表明,生根培养21 d后,有糖培养处理的大豆组培苗的叶片部分出现黄化现象,无糖培养条件下三种大豆组培苗生长健康,叶色浓绿,生根率均为100%(高于有糖培养),中黄25的根鲜重与根长指标达到最大值,分别为1.02 g和481.6 cm,鑫豆1号的根系活力最高,达到78.62 UTTC·g-1FW·h-1,中黄13与鑫豆1号的根系活力与其有糖培养处理相比差异显著.因此,无糖培养提高了大豆组培苗对环境的适应能力,促进了组培苗的生长发育.     

蔗糖脂肪酸酯调节大豆叶片蔗糖酶生物合成机理研究

2mmol/L的SFE能显著地提高大豆蔗糖酶的活力.SDS-PAGE结果表明SFE主要通过增加大豆叶片蔗糖酶的生物合成量来大幅度地提高蔗糖酶的活力.用转录抑制剂AMD(8mg/L)和翻译抑制剂CHI(1.5mg/L)处理大豆叶片,发现它们都能在较短时间内大幅度地降低蔗糖酶的活性.SFE对大豆开花期和结荚期的蔗糖酶生物合成量的增加是通过SFE促进蔗糖酶的转录水平和翻译水平来实现的,转录起主要作用.     

苎麻不同来源原生质体的分离和培养的比较研究

比较了苎麻子叶与子叶悬浮细胞两种材料的原生质体在分离和培养时的差异。取真叶初露期的绿色子叶，用３％纤维素酶、０．５％离析酶的０．６Ｍ甘露醇混合溶液处理５小时，原生质体产量可达５×１０￣６个／ｇｆｒ·ｗｔ，但其原生质体以海藻酸钠包埋方式培养在附加２，４—Ｄ０．５ｍｇ／Ｌ、ＫＴ０．５ｍｇ／ＬＫＭ＿８Ｐ培养基上，原生质体仅发生二次分裂；子叶悬浮细胞只有在纤维素酶４．５％，离析酶０．８％、半纤维素酶０．８％的０．５５Ｍ甘露醇混合液中处理１１小理，原生质体才达最大程度释放，每克悬浮细胞可得原生质体２×１０￣６个，但其原生质体易于诱导分裂，在与前者相同的培养条件下，５０天左右可形成肉眼可见的小愈伤组织，该愈伤组织经过扩增，在不同的培养基上可诱导芽、根的分化，从而形成完整植株。     

花生叶片原生质体游离和培养因子的研究

花生叶片酶解分离原生质体试验表明,植株的苗龄和叶龄对原生质体产量有很大的影响,苗龄１５～２０ｄ的顶部刚平展幼叶是获得高产原生质体的最佳材料。酶浓度和酶解时间是影响原生质体游离和培养的重要因素。通过相关和回归分析,选择较低的酶浓度,较短的酶解时间,并对原生质体产量影响不大的酶处理方法,是原生质体培养成功的关键因子之一。     

荔枝种内原生质体电融合参数研究

选择“桂味”和“妃子笑”两个荔枝(Litchi chinensis Sonn.)品种的花药胚性细胞悬浮系来源的原生质体作融合亲本,在优化电融合参数(排列电压5V,脉冲电压80V,脉冲持续时间45～65 μs,原生质体密度5.0×105～7.5×105个/mL,融合液Ca2+浓度0.2 mmol/L,甘露醇浓度10％～11％)条件下,可获得20％以上双元异核融合率.在亲本原生质体混合前,以0.02％中性红10 min染色“桂味”原生质体,有助于双元异核融合体的有效确认.     

橡胶树原生质体培养研究进展

原生质体培养植株再生体系的建立,可为利用生物技术对橡胶树育种进行品种改良提供良好的受体系统.综述橡胶树原生质体培养的研究进展,并分析影响橡胶树原生质体再生的主要因素:(1)原生质体分离的起始材料;(2)原生质体的分离和纯化;(3)培养基成分;(4)培养方法;(5)品种基因型.     

Isolation and Culture of Pollen Tetrad Protoplasts from <Emphasis Type="Italic">Solanum tuberosum</Emphasis>

Pollen protoplasts provide a sexual and haploid system for haploid production, cell fusion and mutation studies used in plant improvement. Due to the multiploidy, heterozygosity, and often self-incompatibility in tetraploid genotypes, haploid potatoes are desirable for breeding schemes via ploidy manipulations. In this study, two tetraploid varieties and two dihaploid lines of potato were used for pollen tetrad protoplast isolation and culture. The meiotic tetrad buds were first pre-treated at 5 °C for 0–12 days, then the tetrads were transferred into enzyme solutions containing different concentrations of snailase (0.5–1.5%), 0.3 M osmolites (sucrose, mannitol, glucose or sorbitol), 1.0% Cellulose, 0.5% Hemicellulase, 0.5% Pectolyase, 0.3% Sucrose, 3 mM 2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid, 1% polyvinyl pyrrolidone, 0.01% casein hydrolysate and K₃ medium compositions. Among the four donor materials, tetraploid cv. Gannongshu No. 3 (‘GNS No.3’) showed the greatest protoplast yield (74.6 ± 2.4%). In this variety, most of the tetrad protoplasts regenerated a cell wall and continued cell divisions were observed when they were inoculated in K₃ basic medium supplemented with (0.5–1.0) mg/L 2,4-D + (0.1–0.5) mg/L KT + 0.4 mg/L 6-BA +800 mg/L glutamine +100 mg/L serine. ‘GNS No.3’ also showed the greatest first division frequency (21.6 ± 1.5%) and sustained division to form multicellular structures. The study findings suggested that cultured tetrad pollen protoplasts could reverse the gametophytic developmental pattern programmed in vivo to a sporophytic pathway leading to multicellular microspore-derived colonies.     

Improved procedures for the isolation and culture of protoplasts fromSolanum etuberosum

An efficient and convenient procedure for the isolation of protoplasts fromSolanum etuberosum is described. Excised leaves of plants grownin vitro were preconditioned for 3 days in the dark at 4 C. A 16 h enzyme digestion followed with purification by flotation in Babcock bottles produced a mean yield of 12.5 × 10⁶ protoplasts/g fresh weight. Protoplast viability as judged by morphology at the time of isolation was 89%. Liquid preculture for 1 day at 1 × 10⁶ protoplasts/ml was used prior to plating at 1 × 10⁵ protoplasts/ml and gave a mean survival of protoplasts of 43% after 8 days in culture.     

愈伤组织再生马铃薯脱毒苗生产体系的建立

以马铃薯茎尖、茎段、全叶、半叶为外植体,进行愈伤组织的诱导、继代、根芽分化和植株再生的研究,建立马铃薯脱毒再生体系。结果表明:(1)马铃薯茎尖、茎段、半叶、全叶在MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA1 mg·L-1+3%蔗糖+0.6%琼脂培养基中,愈伤组织诱导率分别达到97.3%、75.6%、96.8%、97.4%;(2)在MS+6-BA1.5mg·L-(1或ZT2.0 mg·L-1)+NAA0.5 mg·L-1+GA3 5 mg·L-1+3%蔗糖+0.6%琼脂培养基中不同外植体芽诱导率在15.4%～67.7%,根的分化率21.3%～88.2%。     

拮抗性大豆根瘤菌原生质体制备研究

选用具有拮抗作用的根瘤菌L396,对影响该菌原生质体制备的几个重要因素进行了研究。结果表明:制备原生质体的最佳菌龄为对数生长中期,培养液中加入0.5%青霉素可以促进原生质体的形成,在溶菌酶浓度1.5 mg.mL-1、酶解温度为35℃的情况下可以较快较好的产生原生质体,同时显微观察了原生质体的释放过程。