猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

麻鸭IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性检测

应用RT-PCR技术,直接从麻鸭(Tadorna ferruginea)脾淋巴细胞总RNA中扩增出麻鸭IL-18成熟蛋白(mDuIL-18)基因,克隆到pGEM-T Easy载体。测序结果表明获得了mDuIL-18基因,其大小为513bp,并将该基因亚克隆到原核表达载体pQE30。SDS-PAGE可检测到分子质量为19.76kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在,经变性和复性处理后明显促进鸭T细胞转化。用mDuIL-18(150或200ng/鸭)和禽流感病毒(AIV)疫苗免疫鸭2周后,血凝抑制(HI)抗体平均滴度达到7.5～7.7log2,而只用AIV疫苗免疫和用mDuIL-18(100ng/鸭)和AIV疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3～6.6log2,表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。     

融合基因mChIL-18/mChIFN-α克隆及其原核表达载体的构建

分别以鸡白细胞介素18成熟肽基因(mChIL-18)和鸡α-干扰素成熟肽基因(mChIFN-α)为模板,通过PCR及PCR重叠延伸技术(SOE)得到融合基因mChIL-18mChIFN-α。将融合基因克隆于pGEM-T Easy载体后,再亚克隆到原核表达载体pQE30,并进行测序。测序结果表明获得了阅读框完整、连接部位正确的融合基因mChIL-18mChIFN-α。SDS-PAGE可检测到分子质量为39.4kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。     

猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用

多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能.为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体.首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到pET32a质粒上,构建重组表达载体pET32a-Nanog.将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 kD的Nanog重组蛋白.将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性.结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白.研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具.     

超表达细胞周期蛋白A2基因(CycA2)抑制猪卵母细胞PB1体外排出

在卵母细胞成熟过程中,细胞周期蛋白A2(CyclinA2,CycA2)可与不同周期蛋白依赖激酶(cyclindependent kinase,CDK)相互作用,通过其周期性表达和降解,参与调控细胞周期.为探讨CycA2基因对猪(Sus scrofa)卵母细胞体外成熟的影响,本研究从猪卵巢中克隆CycA2基因,构建野生型pVenus-CycA2和非降解型pVenus-DN157CycA2真核表达载体,转染至hela细胞,确认重组质粒的表达及定位情况.将pVenus-CycA2、pVenus-DN157CycA2体外转录为cRNA,对猪卵母细胞进行显微注射后,体外成熟培养一段时间后统计第一极体排出率,并观察其表达和定位.结果显示,显微注射了pVenus-CycA2、pVenusDN 157CycA2cRNA的卵母细胞,其第一极体(first polar body,PBl)的排出率与对照组相比极其显著降低(P＜0.001,);用Roscovitine处理的pVenus-DN 157CycA2表达的卵可恢复排出PB1的能力,其PB1排出率与对照组相比差异不显著.本研究首次揭示了CycA2基因对猪卵母细胞体外成熟过程的影响,为探索CycA2参与染色体分离调控的分子机制提供理论依据,同时也为进一步研究第二次减数分裂过程中CycA2基因的作用提供了一个平台.     

猪心型脂肪酸结合蛋白基因的克隆及不同生长阶段表达的差异

从1,30,50,70和90kg左右的杜长大猪肌肉组织中提取基因组RNA,用RT-PCR扩增猪心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因,获得1条211bp的片段,以pGEM-T为载体,将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中。从筛选到的阳性克隆中分离出脂肪酸结合蛋白基因,测定其序列。分析表明,该片段为脂肪酸结合蛋白基因cDNA的部分序列,与已报道的猪肌肉组织中的H-FABPcDNA部分序列同源性达到99%。以H-FABP基因片段的克隆为基础,构建了优化的半定量RT-PCR法,以18SrRNA为内标,研究不同生长阶段猪肌肉组织中H-FABP基因表达的差异。结果表明,从出生到50kg,猪H-FABP基因表达呈下降趋势;50～90kg阶段,H-FABP基因的表达又有所上升。     

黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达

通过RT-PCR方法,以黑曲霉(Aspergillus niger)GIM3.452总RNA为模板,克隆出木聚糖酶B(xy-lanase B,xynB)基因的成熟肽编码序列(567 bp),编码188个氨基酸.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretoryprotein,PSP)基因的信号肽序列通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段PSxynB,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSxynB,重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且构建正确.在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-PSxynB转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中测到了木聚糖酶活最高达36.4 IU/mL.     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。     

猫白介素-18基因的分子克隆、序列分析及其表达研究

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因（IL-18）序列，对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞（PBMCf）进行了RT-PCR扩增；将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18，进行核苷酸序列测定，并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp，编码192个氨基酸。在推导的猫IL-18氨基酸序列中，无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点，但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比，猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸和推导的氨基酸序列有较高的同源性，与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将pTIL-18双酶切，回收目的基因片段亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18，转化大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG进行了诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为27.5 kDa的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描，目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

桃WRKY转录因子PpWRKY18克隆及表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究从桃中克隆PpWRKY18基因,通过生物信息学分析PpWRKY18蛋白含有典型WRKY功能结构域。系统进化树分析表明,桃PpWRKY18与蔷薇科物种的亲缘关系最为相近。生物信息学预测PpWRKY18蛋白定位细胞核,并通过农杆菌瞬时注射烟草叶片证实PpWRKY18定位于细胞核。对PGEX-PpWRKY18融合蛋白进行诱导表达,发现PpWRKY18融合蛋白主要在包涵体中表达。荧光定量PCR结果表明,PpWRKY18受干旱诱导表达量上升,复水后PpWRKY18表达量下降。生物信息学预测显示,蛋白磷酸酶蛋白家族(Protein Phosphatase 2C)、C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF蛋白家族(PpERF9)、BHLH蛋白家族(PpBHLH92)可能与PpWRKY18蛋白互作,推测PpWRKY18蛋白通过与这些蛋白互作协同响应干旱胁迫。本研究为探索PpWRKY18响应干旱的分子机制提供了理论依据。     

青海省耕地资源开发利用分析及对策研究

分析论述了青海省耕地资源开发利用的现状、特点和问题。在此基础上,提出了对青海省耕地资源进行研究的框架体系和思路,同时基于GIS/RS技术设计了相关的技术路线。最后依据所做设计对青海省耕地资源开发利用做了初步分析,并进行了相关的对策研究分析。     

Physical Properties of the Soils of Sibay City of the Republic of Bashkortostan

Eurasian Soil Science - The results of the study of the properties of urban soils of the city of Sibay located in the mining region of the Republic of Bashkortostan are presented. A specific...     

荔枝种子结构的扫描电镜观察

荔枝种子从果实中剥离出来后, 即使在室内条件下, 也极易失水干缩, 潮湿环境中又易发霉而腐烂。扫描电镜观察表明: 种皮上布满纹孔, 水分散失面积很大; 种脐部为疏松的海绵组织, 且营养丰富。据此, 生产上应对种子彻底清洗, 并保存于适当湿度的环境中, 以提高其发芽率。     

物联网安全及解决措施

物联网是一个集信息通信、数据交换、传感器技术与软件工程于一体的综合性产业,探讨和分析了物联网的结构体系与发展中遇到的安全问题。     

三门峡水库库岸坍塌成因分析与防治措施研究

三门峡水库自1960年9月蓄水运行以来,库岸坍塌现象频繁发生,平均每年塌岸0.5～0.7亿m3.指出了造成库岸坍塌的原因主要是地质环境的影响以及水力条件的变化;不同的地形、地貌、地质结构和岩性特征,表现了不同的塌岸强度,其中黄土塬区为极强塌岸段,黄河Ⅱ级阶地为强烈塌岸段,黄河Ⅰ级阶地为中等强烈塌岸段;分析了引起库岸坍塌的主要水力条件有大气降水、地表水和地下水,并且不同水力条件及其变化特征,对库岸坍塌影响的方式和程度也不同;最后给出了防治库岸坍塌应采用标本兼治的原则,治标是指对塌岸进行必要的加固、支挡、衬砌等;治本就是根据引起塌岸的原因以及不同地质环境条件下的塌岸特征和水力条件,因地制宜,因害设防,从根本上进行综合治理.     

食用仙人掌萎蔫气象条件分析

塑料大棚内种植的食用仙人掌在土壤墒情较好时也有萎蔫现象发生，通过试验观测和对仙人掌生理习性的分析，发现阴雨过后天气突然放晴温度急剧上升易使仙人掌发生萎蔫现象，并提出了田间管理的应对措施。     

Heterogeneity of Organic Matter of Aggregates of Protocalcic Chernozems

Eurasian Soil Science - Layers were step-by-step removed from macroaggregates (2–1 mm in diameter) of Protocalcic Chernozems via successive abrasion in a revolving rotator during 5, 10, 15,...     

氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用

为观察氟对成年雄性小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用,通过腹腔注射氟化钠建立氟中毒动物模型及锌保护实验。采用石蜡切片、苏木精-伊红染色(HE染色)、末端原位标记(TUNEL)及琼脂糖凝胶电泳的方法检测小鼠生精细胞的凋亡情况。结果显示:(1)氟感染组无论是低剂量组(NaF10 mg/kg)或是高剂量组(NaF 20 mg/kg)生精细胞都发生了明显的凋亡。生精细胞凋亡主要发生在精母细胞和精原细胞,凋亡指数与对照组差异极显著(P<0.05)。(2)无论是高剂量锌(ZnSO430 mg/kg)和低剂量锌(ZnSO415 mg/kg)都可以使凋亡指数明显降低,高剂量锌组的凋亡指数与对照组差异不显著(P>0.05)。     

Characterization of physical and chemical properties of Varzea soils of Goias State of Brazil

Abstract

Brazil has approximately 30 million hectares of lowland areas, known locally as “Varzea,”; distributed throughout the country. Soils in these areas have the potential to support agricultural production, but very little is known about their fertility. The current experiment was undertaken to characterize the chemical and physical properties of representative “Varzea”; soils collected at 0–20, 20–40, 40–60, and 60–80 cm depth intervals from 23 sites in Goias State of Brazil. Organic matter contents averaged 42 g/kg in the surface 20 cm of soil and should make a significant contribution to overall nutrient availability. Soil pH increased slightly with depth from a mean value of 5.2 in the surface 20 cm of soil to a mean value of 5.4 in the 60–80 cm depth interval. Several soils had exchangeable Al values ≥ 1.0 cmol Al/kg, but soil Al saturation was generally less than the 60% level frequently associated with Al toxicity. However, cereal and legume production could benefit from lime addition in many of these soils. Although base saturation was fairly low in some soils, exchangeable Ca and Mg levels were, in general, adequate throughout the profile. Extractable P levels were adequate in most surface soil samples. Extractable K levels in these soils were generally low, and the application of K fertilizers should be beneficial, especially in conjunction with lime addition. The high clay content “Varzea”; soils of the Brazilian lowlands have some drainage problems but generally exhibit favorable chemical properties for crop production when compared to soils of the well‐drained Cerrados.