巢式PCR和SYBR Green I实时PCR检测转基因大豆方法的研究

为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green I实时PCR技术,检测转基因大豆 外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS).结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1％　的大豆中　的CaMV35S基因,而轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green I染料能结合双链DNA的 特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解 曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL.同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分.巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限, SYBR Green I实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分.     

SYBR Green Ⅰ实时PCR技术鉴定鸭源性成分的研究

为建立灵敏、可靠的食品中鸭源性成分鉴定方法,确定了一对可特异地检测出牛肉中所掺杂鸭肉成分的引物,建立了SYBR Green Ⅰ实时PCR技术检测鸭肉的方法.结果表明:利用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术可检测到鸭肉DNA,通过熔解曲线能有效地区分特异性产物,检测灵敏度可达到1 pgDNA.同时利用该方法可检测出熟牛肉、鸭肉混合样品中的鸭肉成分.SYBR Green Ⅰ实时PCR方法能快速、特异、灵敏的检测鸭肉成分.     

实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究

以转基因大豆Roundup Ready为材料，通过特异性引物和探针，对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测。研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法，但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度，其检测阈值可降到0.05%，变异系数为0.09%~0.53%。在此基础上，建立和优化了Taqman探针实时荧光定量PCR检测技术体系，有助于提高转基因作物及产品的生物安全性定量检测的准确度和可靠性。     

SYBR GreenⅡ黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR方法的建立

利用SYBR GreenⅡ染料法,建立黄芩实时荧光定量PCR的反应体系。根据18S rRNA基因序列保守性,在18S rRNA基因保守区设计一对特异性引物,以常规PCR产物为标准品,浓度梯度稀释后制定标准曲线,对溶解曲线进行分析,对PCR退火温度,引物浓度,模板浓度等反应条件进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,加入10μL SYBR Premix Ex Taq TM时,引物和cDNA最佳加入量分别为0.8μL和1.0μL;最佳反应程序:进行40次循环,95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s。标准曲线Ct的检测范围在14～29,扩增效率为97.8%;溶解曲线显示为单峰,其Tm为(85±1.0)℃。本研究建立的黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR法,具有检测范围广,扩增效率高,特异性高等优点,对从分子水平阐明黄芩药效成分合成机制,筛选高产优质的黄芩种质资源具有重要的意义。     

定量PCR技术检测转基因玉米的研究

以Bt176转基因玉米为材料,通过使用特异性引物和染料,对转基因玉米中外源基因cry1Ab进行了定量检测。研究发现,在优化检测体系的基础上,SYBR荧光染料法定量检测转基因玉米,具有更高的检测灵敏度和精确度,其检测阈值可降到0.05%,变异系数为0.09%~0.53%。     

转基因耐除草剂大豆ZH10-6实时荧光定量PCR检测方法的建立

转基因耐除草剂大豆ZH10-6是含有G2-EPSPS基因和GAT基因耐除草剂大豆新品系,对广谱型除草剂草甘膦具有耐受性,在中国具有重要产业化应用前景.本研究以其转化体特异性序列为靶标,建立了基于Taqman水解探针的实时荧光定量PCR检测方法.该方法能特异、定量检测出转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体成分,线性度大于...     

SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立

为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析.结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1 μmol/L和50 ng/μL.最佳PCR反应程序为:94℃预变性30 s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30 s,72℃延伸40 s,最后加做熔解曲线82℃1 s.结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因.本研究成功建立了2-△△CT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究.     

实时荧光PCR定性检测菜籽粕中转基因成分的研究

本文针对使用实时荧光PCR对深加工的饲料菜籽粕进行转基因检测的研究,就DNA抽提、纯化和实时荧光PCR过程中使用样品DNA的最适浓度等方面,对检测方法进行了适当的改进,并探讨了如何根据所得荧光曲线的Ct值判定菜籽粕中是否含有转基因成分.     

SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台.     

半巢式反转录实时荧光PCR检测马铃薯黑环斑病毒

本研究根据基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式反转录实时荧光PCR检测PBRSV的新方法.该方法采用E.Z.N.A TM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式反转录实时荧光PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达300fg/μL植物总RNA.     

转基因大豆种子、豆粕定性PCR检测方法的研究与应用

利用定性PCR检测方法,以大豆凝集素基因(Lectin)为内标基因,检测了转基因大豆种子、豆粕中的四个外源基因:35S-CTP基因、Cp4-epsps基因、nos终止子基因、CaMV35S启动子基因,并通过酶切(XmnI)验证试验验证了定性PCR检测结果的准确性,建立了定性PCR检测转基因大豆种子、豆粕的方法,利用市场上抽检到的大豆种子、豆粕样品,进行了实际检测工作.     

转基因甜菜H7-1实时荧光PCR检测方法

运用实时荧光PCR方法对转基因甜菜H7-1外源基因FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS外源基因和品系特异性进行了检测.建立了快速、准确的转基因甜菜H7-1转基因成分的PCR检测方法.本研究采用的FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS和品系特异性检测引物探针能有效检测转基因甜菜H7-1中转基因成分,具有特异性,且灵敏度达到0.01％.     

转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法研究

本研究建立了转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法.根据A2704-12转化体外源插入片段5'端与大豆基因组连接区序列设计特异性引物,以大豆内源基因Lectin为内标,从A2704-12转化体中特异性扩增出239 by大小的特异性目的片段.同时对该方法特异性和灵敏度进行测试,结果显示:该方法能检测出A27...     

玉米转基因成分三重实时荧光PCR筛选检测

本研究开发建立了三重实时荧光PCR反应体系对玉米及其加工制品的转基因成分进行高通量快速检测。以玉米单拷贝内源基因adh1(编码乙醇脱氢酶的基因)、启动子(35S promoter from cauliflower mosaic virus, p-35S)和t-NOS终止子(terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens, t-NOS)等常用转基因元件为靶标基因,以转基因玉米MON863、NK603、MON810、Bt11,非转基因玉米粉2019054以及转基因大豆粉,棉花籽和小麦粉等非玉米农作物样本共8份测试样品进行方法特异性分析,对10个玉米品系种子样本和41份玉米食品样品进行方法适用性分析和日常样本筛查检测,用标准曲线法验证方法的检测低限和重复性。结果表明该体系能在转基因阳性样本DNA为模板的一个反应管中同时检出3个靶标基因,在非转基因的玉米样本中仅检出内源基因,检测结果符合标示值;adh1、p-35S和t-NOS三种靶标基因扩增效率分别为96.84%、94.92%和93.80%,线性相关系数分...     

以实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米MON88017

根据转基因玉米MON88017的左侧侧翼序列和玉米内标基因(zSSIIb)分别设计特异性引物及Taqman探针,通过实时荧光PCR技术建立MON88017的定量特异性检测方法。利用含有内标基因和侧翼序列的标准质粒分子,建立了玉米内标基因和侧翼序列的标准曲线。检测了5个已知MON88017含量(0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%)的混合样品中的转基因含量,结果表明检测底限可以达到19~30个阳性拷贝。该研究建立的实时荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强。     

基于实时荧光定量PCR对转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测

转基因植物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术并以番茄抗坏血酸过氧化物酶apx(ascorbate peroxidase)基因和光诱导的早期蛋白elip(early light inducible protein)基因为内参开展对12株转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测。研究结果表明:常规番茄使用的内参基因apx在樱桃番茄中可能以多拷贝形式存在;以elip基因为内参检测到转基因植株内整合的拷贝数为0~20不等,其中4株在普通PCR检测中存在假阳性,且80%的转基因植株发生了基因重排现象。     

抗旱水稻种子转基因成分检测技术研究

利用组织研磨仪快速处理水稻种子样品,采用高通量的磁珠纯化系统提取样本DNA,提取的核酸通过紫外吸收检测其纯度,应用普通PCR检测方法和实时荧光PCR方法对水稻内源基因SPS、靶基因ATAF1进行检测。结果表明,普通PCR方法和实时荧光PCR方法均表现快速、准确、特异性高的特点。     

黑龙江省大豆产区疑似转基因大豆的分子检测

利用表型鉴定和PCR分子检测相结合的方法,对黑龙江省国储库拒收的疑似转基因大豆进行了转基因成分检测.表型鉴定方法为草甘膦叶片涂抹,PCR分子检测对象为CaMV35S启动子、NOS终止子及目的基因CP4-EPSPS.利用大豆自身的凝集素基因作为PCR检测的内标基因,以有效排除DNA质量、实验操作等因素对检测结果的影响.结果表明,所测材料不抗草甘膦除草剂,也不合所检测的外源基因,由此判断该批次材料不是转基因大豆.     

实时荧光定量PCR技术在转基因玉米检测中的应用研究

采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异的引物和探针，对玉米中的内源基因Invertase和转基因玉米Mon 810、Event 176中的外源基因进行了定量检测，建立了商业化转基因玉米Mon 810 (YieldGard)和Event 176 (Maximizer)的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度小于0.01％，是国际上设定的转基因最低限量的100倍。     

抗草甘膦转基因大豆生物测定方法的研究

本研究以非转基因大豆品种黑农37及其3对具有相似遗传背景的大豆抗性品种为材料,分析了室内生物测定法和田间鉴定法的相关性,探讨了光照和黑暗处理对生物测定法鉴定的影响,旨在建立简便快捷的抗性鉴定方法,为培育抗除草剂大豆新品种提供指导。结果表明,光照条件下大豆对草甘膦更为敏感,而且可以用种子发芽过程中下胚轴的抑制率作为评价的标准。利用室内生物测定法分析对草甘膦非常敏感的大豆品种黑农37,其结果可以反映黑农37在田间条件下对草甘膦的抗性。表明本研究建立的快速检测抗草甘膦转基因大豆的室内生物测定方法可以反映大豆对草甘膦的抗性。