吖啶橙免疫荧光菌团法快速检测鱼贝类副溶血性弧菌的研究

本研究建立了适用于检测鱼贝类副溶血性弧菌的吖啶橙免疫荧光菌团培养—沉淀法.用该法可检出每毫升含10万个细菌的菌悬液,不与沙门氏菌、大肠杆菌、猪丹毒杆菌等7种杂菌发生交叉反应.采用随机抽样法对从长春市各大市场采集的351份海产鱼贝类样品进行了检测,其阳性率为46.4%,常规培养法检出率为49.8%,两者相差不显著(P>0.05).该法可在27h之内报告结果,而常规培养法需5～7d.该法具有特异性强、敏感性高、简便快速、所需仪器简单等特点,适用于大样本的检测和基层单位使用.     

吖啶橙免疫荧光菌团法对肉品和鲜乳中小肠结肠耶氏菌快速检出的实验研究

对应用吖啶橙免疫荧光菌团法(培养法和沉淀法)快速检出小肠结肠耶氏菌的敏感性和特异性进行了实验研究,进而应用先增菌再菌团法的检测程序,对肉品模拟标本和198份肉品和鲜乳实际样品进行了检测,并与常规分离培养法作了对比,证明菌团法于13.5×10~2～10~3个攻/ml以上时,出现典型荧光菌团,与13种杂菌不形成菌团交叉;与杂菌比在1:400以下菌团形成不受干扰;与常规培养法的阳性检出率无显著差异(P>0.05);40h以内即可获得结果,较常规分离培养时间(一般4d左右)大为缩短。     

吖啶橙免疫荧光菌团法快速检测空肠弯曲菌的研究

本研究建立了适用于快速检测空肠弯曲菌的吖啶橙免疫荧光苗团培养沉淀法。用该法可检出每毫升接种约40个菌,增菌24h的培养物或每毫升合约10万个菌的菌悬液,不与水弧菌、大肠杆菌等13种杂菌发生交叉反应。对貉、水貂、獭兔和熊等经济动物310份肛拭样本进行了检测,其阳性率分别为66％、19％、21％、29％,与常规培养法均相差不显苦(P>0.05),可在27h内报告结果,而常规培养法则需要5～7d。该法适用于大样本的检测和基层单位应用。     

生物素-亲和素斑点酶联免疫吸附试验快速检测鱼源副溶血性弧菌的研究

本研究建立了快速检测鱼源副溶血性弧菌的BA-Dot-ELISA方法.用该法可检出每毫升接种10个菌,增菌18h的培养物.该法敏感性为10~4个/mL,比Dot-ELISA敏感10～100倍.不与溶藻性弧菌、亲水气单胞菌等13种杂菌发生交叉反应.增菌前杂菌多于副溶血性弧菌10~6时,对检测结果有影响.可在22～24h报告结果,比常规培养法快4～6d以该法对带鱼、小黄花鱼、马面鱼、鲤鱼等311份样本进行检测,检出率分别为47.0%、41.7%、14.8%和11.8%,与常规培养法相差不显著(P>0.05).生化试验复检结果表明,检出的阳性可凝菌株均为副溶血性弧菌.该法适用于在短时间内对大批样本的检测.     

应用酶标抗体染色法实验检定空肠弯曲菌

应用酶标抗体染色法检定空肠弯曲菌,具有较高的特异性及敏感性,除金黄色葡萄球菌呈现轻度着染外(可以从形态学上排除),对沙门氏菌等9种杂菌均不发生非特异性染色反应;用以检查空肠弯曲菌纯培养物,敏感性可达400万个菌/ml。对同时接种10个空肠弯曲菌和1亿个杂菌的30h选择性增菌肉汤培养物,酶染色法可准确地检出,而且不受杂菌的干扰。检查47份鸡粪便标本和38株猪源空肠弯曲菌,其结果与常规细菌分离鉴定结果相同。建立的检定空肠弯曲菌的酶标抗体染色法可在2h内完成。     

肽核酸荧光原位杂交技术检测生肉中沙门氏菌方法的建立及应用

本研究设计了一种基于沙门氏菌毒力基因侵袭蛋白A(invA)的特异性肽核酸(PNA)探针,在前期优化条件的基础上,建立并评估了沙门氏菌肽核酸荧光原位杂交(PNA-FISH)的检测方法。特异性试验结果显示,该方法的Sal-invA探针除对目标菌杂交呈阳性外,与12株常见的非目标菌杂交均为阴性,特异性强;灵敏度试验结果显示,该方法对沙门氏菌的检测限为10~5cfu/mL,而荧光定量PCR方法和细菌分离培养法对沙门氏菌的最低检测限分别为10~2cfu/mL和10~5cfu/mL,PNA-FISH方法的灵敏度与分离培养方法相近。人工污染沙门氏菌的生肉制品,增菌培养后经上述3种方法检测的最低检测限均可达到100cfu/mL。对83份生鲜肉经增菌培养后,用上述3种方法检测。结果显示,该方法与细菌分离培养方法和荧光定量PCR方法的符合率均达到98.8%。表明,增菌培养是提高该PNA-FISH检测方法灵敏性的重要步骤。本研究建立的检测沙门氏菌的PNA-FISH方法快速、准确、灵敏,适合用于临床肉制品的检测。     

荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌方法的建立及初步应用

根据编码鼠伤寒沙门氏菌肠毒素stn基因的核苷酸序列设计1对引物和荧光探针，通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索，建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究结果显示，该方法检测沙门氏菌结果均为阳性，而非沙门氏菌均为阴性；对带有沙门氏菌肠毒素stn基因的阳性质粒的检测敏感性为4个／μL。用该方法对人工污染沙门氏菌的鲜猪肉和鲜鸡蛋进行检测，当检样中沙门氏菌初始含菌量分别为1CFU／g（鲜猪肉）和1CFU／g（鲜鸡蛋），经过12h的增菌后，检测结果均为阳性。该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点。此研究为食品中沙门氏菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。     

食源性沙门氏菌快速检测技术的应用研究

通过样品试验,得到优化的沙门氏菌检验方法,了解上海地区沙门氏菌 污染情况.在免疫胶体金技术、单抗直接ELISA、PCR法检测沙门氏菌的基础上,将 PCR法和单抗直接ELISA三种快速检测方法进行比较研究.用免疫胶体金技术、直接E LISA、PCR法对鸡蛋、水样、牛奶、猪肉、牛肉、虾仁等样品401份进行沙门氏菌检测,并与 常规国标方法对比,直接ELISA法的敏感性和特异性达100%和97.3%,免疫胶体金技术敏感 性和特异性达100%和95.3%,PCR法的敏感性和特异性均为100%.通过对样品的检测, 最终确定较优化的沙门氏菌检测程序.PCR法的特异性优于免疫胶体金技术和直接ELISA法.对大量样品检测,可采用免疫胶体金技术或直接ELISA法筛检,除去大量阴性样品,阳性样品用PCR法作进一步鉴定;需要确定血清型时则用国标法.     

应用PCR检测单核细胞增多症李氏菌的研究

以二对位于单核细胞增多症李氏菌β－溶血素基因内的２６－ｂｐ寡核苷酸为引物，用ＰＣＲ对单核细胞增多症李氏菌进行了检测，结果所有株单核细胞增多症李氏菌均扩增出１８６－ｂＰ的特异条带，其它种李氏菌和细菌均呈阴性反应。本方法可测出模拟肉样中少至９２个细菌，模拟奶样中少至１８个细菌，其特异性和敏感性不受其它污染杂菌ＤＮＡ的影响。对市售猪肉和牛奶的检测结果表明，ＰＣＲ法优于传统的分离培养法，具有快速、简便和敏     

鸡白痢沙门氏菌PCR检测技术的建立与应用

为鸡沙门氏菌的临床检测提供了一种更快速、敏感、特异的诊断,参照GeneBank中已公布的的鸡白痢沙门氏菌fliC基因序列,合成出了一对引物,使用PCR法对1株沙门氏标准菌株和其他3株非沙门氏菌标准菌株进行DNA抽提扩增并检测其敏感度。采用上述技术,对12份可疑病料及10份饲料进行PCR检测,同时与传统检测方法进行比较。结果表明1株沙门氏菌PCR产物出现600 bp的特异性DNA扩增带,而非沙门氏菌均未出现扩增条带,证明所设计引物具有沙门氏菌特异性;通过敏感度检测,此PCR体系能检出50 pg以上的细菌DNA,敏感性较高。运用PCR法阳性检出率及敏感性均高于常规检测方法。由此可见,沙门氏菌PCR检测是一种快速、敏感和高度特异的诊断方法。     

吖啶橙免疫荧光菌团法快速检测鱼源红斑丹毒丝菌的实验研究

研究建立了快速检测红斑丹毒丝菌的吖啶橙免疫荧光菌团离心培养法。该方法能检出560个菌在选择性肉汤中10h的培养物或每毫升含5×10~4个菌的抗原悬液;不与李氏杆菌等16种其他细菌发生反应;操作简便,不需要特殊的仪器设备,可于15～18h内报告结果(常规分离法需2～3d);应用离心培养法与常规分离法检测了325尾鲜鱼,阳性率分别为48.0％和55.7％,两者无显著差异(p>0.05)。从鱼体分离出的红斑丹毒丝菌的大多数菌株(18/19)具有毒力;对分离菌株的血清型鉴定发现,有3株菌可能是新的血清型。     

乳胶凝集试验检测牛羊淋巴结中的沙门氏菌

采用沙门氏菌多价血清致敏乳胶并制成乳胶抗体,建立沙门氏菌乳胶凝集试验检测方法(LAT),分别用LAT法和常规分离培养检测法对38份牛淋巴结、101份羊淋巴结进行检测.结果:乳胶凝集试验牛淋巴结阳性21份,羊淋巴结阳性44份;常规分离培养检测法牛淋巴结阳性22份,羊淋巴结阳性48份,两种方法的阳性符合率均超过80%.试验表明乳胶凝集试验操作简便、快速、敏感性高、特异性强且可用于现场检测,是一种适合基层单位检测沙门氏菌的可靠方法.     

LUX^TM荧光PCR快速检测沙门氏菌的研究

本研究针对沙门氏菌invA基因的保守序列,设计特异的LUX^TM荧光标记引物,通过优化反应奈件和参数,建立可快速检测沙门氏菌的LUX^TM荧光PCR检测方法。结果显示,该方法高度敏感,其对纯菌的检测低限达到10^2cfu／mL,经6h增菌培养后检测,对样品液的检测低限达到1cfu／mL;特异性强,测试的全部13株沙门氏菌标准和参考菌株均呈阳性反应,测试的全部27株非目标菌均呈阴性反应;重复性好,定量检测批内和批间的变异系数均小于2％。应用本方法检测食品样品240份,结果检出阳性4份,与TaqMan荧光PCR和SN标准检测结果完全一致。本方法可在8h内完成对样品中沙门氏菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,且检测成本较低。     

沙门氏菌通用PCR快速检测试剂盒的研制与应用

根据沙门氏菌fimY基因建立了用于检测沙门氏菌的通用PCR方法。对收集的A-F群标准菌株和临床分离的60株沙门氏菌分离株和11种非沙门氏菌进行PCR检测,采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果所有沙门氏菌均扩增出526bp的特异性条带,而非沙门氏菌均未扩增出任何条带。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中93cfu的沙门氏菌,还可检出含3cfu的样品用BP预增菌或MM增菌后的菌液。说明该方法敏感性高、特异性强。采用直接菌体加入法、热裂解、反复冻融、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板,结果CTAB法效果最好,但操作烦琐,而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒同样的效果,且操作简便快速、经济、效果好,值得推广应用。     

BA-ELISA快速检测鱼源沙门氏菌的研究

本研究建立了快速检测鱼源沙门氏菌的BA-ELISA工作程序。该程序灵敏度为105个/mL,可经受108个/mL杂菌的干扰,对含有10个以上沙门氏菌的接种标本经21～23h两步增菌后即可检出,可在25～27h内报告结果,比常规分离培养方法缩短3～5d。从6个品种的498尾淡水鱼和7个品种的160尾海水鱼,共采集标本778份,以常规分离培养法检出29份阳性标本,分离率为3.7%。对包括该29份分离阳性标本在内的184份鱼源标本实施BA-ELISA的结果表明,两法的符合率为96.73%,BA-ELISA法的敏感性为100%(29/29),特异性为96.1%(149/155)。独立性检验表明,两法检测结果间有极显著意义的一致性(P<0.01)。血清学分型表明,分离的菌株全部为鼠伤寒沙门氏菌(1,4,5,12:i:1,2)。     

PCR技术检测饲料中沙门氏菌的应用研究

用聚合酶链反应(PCR)技术检测饲料中沙门氏菌,对已知被沙门氏菌污染的动物饲料培养物均能检出阳性,说明本方法对检测饲料中沙门氏菌具有特异性高、灵敏、快速等特点,适用于快速、准确地检测饲料中沙门氏菌的需要。     

用PCR技术检测动物产品中沙门氏菌的研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测沙门氏菌，结果表明，对各种不同血清型的沙门氏菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤培养物均检出阳性，而其他的枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌，大肠艾希氏杆菌、缓慢爱德华氏菌和嗜水气单胞菌等非沙门氏菌类，均为阴性。证明本方法特异性高且有灵敏、快速等特点，适用于口岸检疫进出境动物产品快速、准确验放的需要。     

金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法,本研究根据该菌耐热核酸酶nuc基因的保守序列,设计特异性RPA扩增引物,并经反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。结果显示:建立的金黄色葡萄球菌快速检测方法可在37℃孵育35 min特异性检测金黄色葡萄球菌,而对其它病原的检测结果为阴性,特异性较强;对该菌的纯培养物和人工污染该菌的牛奶样品中的最低检出限均为10 cfu,敏感性高。利用该方法和国标培养法同时检测市场购买的牛奶样品和猪肉样品,结果显示二者检测结果一致。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高且不依赖于昂贵的仪器设备,适用于基层实验室检测。     

单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×10~2拷贝/μL和10~3cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。     

单抗酶联试剂盒与PCR方法快速检测沙门氏菌的比较

本文对单抗酶联试剂盒与PCR方法快速检测沙门氏菌进行了比较。将沙门氏菌与大肠杆菌以不同比例混合后 ,分别用ELISA和PCR法检测 ,在 1∶1 0 0的比例时 ,用这 2种方法均能检测出阳性样品 ;在 1∶1 0 0 0的比例时 ,用ELISA法检测为阴性 ,而用PCR法则能检测出。检测鲜牛奶、龙虾、虾仁、熟食制品等样品 ,2种方法的符合率达 97 6 %。对冻虾仁、人粪便样品的前增菌、选择性增菌、后增菌过程进行同步检测 ,在样品的前增菌液 ,直接ELISA法检测的OD值小于 0 5 ,而PCR法扩增能出现特异条带 ,经国标方法验证为阳性 ,证实PCR法的敏感性优于直接ELISA法 ,而在选择性增菌液和M 肉汤后增菌液中 ,2种方法均能检出阳性样品。