节节麦HWM-GS D~tx5与普通小麦HWM-GS Dx5亚基的AS-PCR鉴别

高分子量谷蛋白(HMW-GS)是小麦的重要储藏蛋白之一,决定小麦烘烤品质,其中HMW-GS Glu-D1位点与面包烘烤品质的关系最为密切。人工合成小麦(synthetic hexaploid wheat,SHW)继承了节节麦D基因组丰富的遗传变异,是高效利用野生祖先种优良基因的重要桥梁资源;近年来随着人工合成小麦在小麦遗传育种中的不断应用,来自节节麦类群的大量高分子量谷蛋白亚基类型越来越多的涌向普通小麦。而传统SDS-PAGE无法区分节节麦HMW-GS Dtx5和普通小麦Dx5亚基,鉴于此本研究利用节节麦HMW-GS Dtx5亚基和普通小麦HMW-GS Dx5亚基DNA序列之间存在的几个SNPs差异开发出等位特异PCR(allele specific polymerase chain reaction,AS-PCR)引物,通过PCR方法来区分两种不同来源的5亚基。结果显示,所设计出的两对引物都能够扩增出清晰稳定的目标条带,并且两对引物的扩增结果一致,含HMW-GS Dx5亚基的表现为阳性带,含节节麦来源的Dtx5亚基表现为阴性;同源性分析表明Dtx5亚基与Dx2亚基氨基酸序列的同源性要高于Dtx5与Dx5之间的同源性。     

基于琼脂糖凝胶电泳的小麦SSR扩增体系优化

以小麦基因组DNA为试验材料,探索SSR扩增反应中5种反应组分(模板DNA、dNTPs、引物、Mg~(2+)和Taq DNA聚合酶)对SSR扩增结果的影响.研究发现,引物、Mg~(2+)和Taq DNA聚合酶对PCR扩增结果的影响最显著,其次是模板DNA,dNTP对PCR扩增结果的影响不明显.此外,借助该优化的SSR反应体系,对小麦7B染色体上的多对SSR引物进行了多态性筛选.试验结果表明,优化的SSR扩增体系结合高浓度琼脂糖凝胶能够对显性或差异显著的共显性标记进行高效分离.     

硬粒小麦Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发

获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了1对简并引物, 以从硬粒小麦品种Langdon BAC文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的BAC为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了1个MET类型的小麦低分子量谷蛋白基因LMWLDN-M, 该基因编码350个氨基酸。利用LMWLDN-M与本实验室克隆的Langdon品种其他类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以Langdon代换系和中国春小麦缺体-四体为模板进行PCR扩增, 将该基因定位到小麦B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为Glu-B3基因家族的一个新成员。     

硬粒小麦Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发

获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了1对简并引物, 以从硬粒小麦品种Langdon BAC文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的BAC为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了1个MET类型的小麦低分子量谷蛋白基因LMWLDN-M, 该基因编码350个氨基酸。利用LMWLDN-M与本实验室克隆的Langdon品种其他类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以Langdon代换系和中国春小麦缺体-四体为模板进行PCR扩增, 将该基因定位到小麦B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为Glu-B3基因家族的一个新成员。     

小麦微卫星引物对多枝赖草基因组DNA扩增的研究

用227对小麦微卫星引物对多枝赖草基因组DNA进行PCR扩增，共有81对引物有扩增产物，占所用引物的35．7％。这81对小麦微卫星引物涉及101个微卫星位点，覆盖了小麦全部7个部分同源群。其中有76对引物可在多枝赖草和中国春及丰抗13问扩增出多态性标记。这说明多枝赖草虽然和普通小麦亲缘关系较远，但小麦SSR引物还是可以在多枝赖草上应用的，这不仅拓宽了小麦微卫星引物的使用范围，更重要的是为使用小麦微卫星引物对普通小麦与多枝赖草远缘杂交种质材料进行深入研究奠定了基础。     

抗条锈小滨麦易位系的鉴定

从八倍体小滨麦与普通小麦杂种后代中筛选到一个农艺性状优良的抗条锈小滨麦种质系山农0096，细胞学观察结果表明其根尖细胞染色体2n=42，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ（PMC MⅠ）染色体构型为2n＝21Ⅱ；它与小麦亲本的杂种F1 PMC MⅠ染色体构型平均值为2n＝19Ⅱ＋1Ⅳ。RAPD分析表明：在100个十聚体核苷酸随机引物中，有3个引物     

小麦穗发芽抗性相关基因Tamyb10-D1特异性分子标记开发

Tamyb10-D1基因与穗发芽抗性相关,已报道的该基因分子标记扩增产物大,对DNA模板质量要求较高,PCR反应耗时长。为了使该基因在小麦分子育种中得到高效和快速利用,本研究设计了多个引物组合,经检测可特异性地扩增3D基因组上的Tamyb10基因,引物组合380s/703a、380s/1182a、652s/1182a、872s/1182a和872s/1419a扩增效果较好,而且含有652s或703a的引物组合可区分小麦属和粗山羊草属的myb10-D1基因型。鉴于这些分子标记为显性标记,通过多重PCR反应,可确保PCR检测结果的准确性。其中用引物组合380s/652s/872s/1182a进行三重PCR检测Tamyb10-D1基因型结果较好。因此,本研究开发的分子标记可应用于Tamyb10-D1基因的基因型检测和分子辅助育种,对于小麦穗发芽抗性育种工作具有一定的应用价值。     

小偃麦异附加系TaTGA4转录因子基因的克隆与生物信息学分析

本研究利用Genefishing技术,从经过白粉病菌E09诱导处理12 h的高抗白粉病菌小偃麦(小麦-中间偃麦草异附加系)种质SN6306的c DNA中获得上调表达差异片段,经克隆测序,获得一个375 bp的序列。在NCBI数据库和小麦全长数据库Tri FLDB中进行相似性比对,预测其为TGA4转录因子的一段序列。设计序列的特异引物,经PCR扩增,从SN6306中克隆到小麦Ta TGA4基因的c DNA全长序列,并对该基因及其所编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。结果表明,Ta TGA4基因序列的开放阅读框长度为1 221 bp,编码含406个氨基酸残基的蛋白。BLASTP相似性比对分析显示,Ta TGA4含有b_ZIP1超家族与DOG1超家族两个保守结构域,且该蛋白与小麦的近缘物种节节麦中的同源蛋白一致性达到92%,与乌拉尔图小麦中的同源蛋白一致性达到90%。从多序列联配及系统进化树分析中可以推断出Ta TGA4属于TGA4转录因子类。本研究可为Ta TGA4基因在小麦抗白粉病中的功能研究打下基础。     

斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR检测

旨在建立一种快速、可靠的斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒(Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus, SpltNPV)的分子检测方法，以克服目前常规PCR技术很难检测到斜纹夜蛾成虫带病毒的缺陷。以SpltNPV的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,egt)基因为检测对象，基于该基因序列设计了巢式PCR引物，其中一对外侧引物egt-F/R和一对内侧引物egt1-F/R，并研究斜纹夜蛾成虫带毒的巢式PCR检测可靠性。结果表明：基于egt基因的巢式PCR方法可以特异性扩增SpltNPV的DNA，引物egt-F/R的扩增检测最低限为10-7μg/μL；且基于引物egt-F/R的两轮普通PCR无法检测出成虫带毒，而采用巢式PCR方法可有效扩增出目的egt片段，巢式PCR检测方法的灵敏度比两轮普通PCR检测方法提高2个数量级。因此，本研究成功建立了基于SpltNPV的egt基因的巢式PCR检测技术，该方法为斜纹夜蛾成虫带毒、传毒等流行病学研究提供了可靠的技术支撑。     

冬小麦黄矮病毒的分子生物学鉴定试验研究

本研究以检测冬小麦黄矮病毒(BYDV-PAV)的分子生物学特征为目的。首先,通过电击法将3种质粒(UV1304、UV1306、UV1304rtd)转化土壤农杆菌(EHA105、4404,GV3101等)。然后,通过机械损伤使含有上述质粒的农杆菌侵染小麦(西农749、小偃6号、张氏3个品种),并将侵染后的小麦放在室外进行处理,至表现出感染病毒的症状时提取病毒RNA并进行检测。经过一段时间的处理后,只有西农749表现出症状,RNA电泳也显示出提取物中存在RNA,但是经过RT-PCR反转录然后再PCR扩增c DNA后进行电泳出现负结果。3种质粒的c DNA电泳结果出现相似现象:以CP5′+MPR1为引物得到的c DNA电泳均无条带;其他引物得到的c DNA电泳均显示相似的条带,而且因引物不同条带位置也不同。     

3个新疆地方小麦品种Glu-A3位点低分子量谷蛋白亚基新基因的序列分析

麦谷蛋白可分为高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS),其中低分子量麦谷蛋白亚基对小麦品质具有重要影响.本文采用PCR方法从中国小麦微核心种质中的3个新疆小麦品种红春麦(新疆玛纳斯)、红春麦(新疆昌吉)和红金包银(新疆伊吾)中分别得到了3个低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-CS)新基因(GenBank:DQ519084、DQ519085和DQ517534).它们具有LMW-i型基因的典型结构特征,与已报道的Glu-A3位点编码的LMW-GS基因序列有很高的一致性,高达79.06%～94.24%.DQ519084和DQ517534在C末端保守区有9个半胱氨酸残基,DQ519085其编码区内存在1个提前终止密码子,推测其为假基因.     

低分子量谷蛋白亚基GlU-A3和GlU-B3位点对小麦面筋强度和烘焙特性影响

低分子量谷蛋白亚基是小麦谷蛋白亚基的重要组成部分,黄淮麦区小麦低分子量谷蛋白亚基组成对品质的效应尚缺乏系统的研究。本研究采用SDS-PAGE方法,鉴定了黄淮麦区42个小麦品种的Glu-A3位点和Glu-B3位点低分子量谷蛋白亚基组成,分析了低分子量谷蛋白亚基对小麦面筋强度和烘烤品质的影响。结果表明,在Glu-A3位点,对面筋强度和面包烘焙品质正向效应为:d,b>a,e;在Glu-B3位点,对面筋强度正效应为:h,d>f>g,b,j,对面包烘焙品质正向效应为:h>f,d>g,b,j。Glu-A3d/Glu-B3h亚基组合具有较好的面筋强度和烘焙品质。就低分子量谷蛋白亚基单个变异位点对品质综合效应而言,Glu-B3位点对品质作用比较大,与Glu-B1位点相近,同时,高低分子量谷蛋白亚基之间存在着互作效应,以Glu-B1/Glu-A3和Glu-D1/Glu-B3位点的互作效应比较显著。Glu-A3和Glu-B3位点及其所编码的不同亚基种类对品质的效应差异显著,并且与高分子量谷蛋白亚基位点存在互作,对不同位点优质亚基的聚合将有助于小麦品质的遗传改良。     

普通小麦近缘种低分子量麦谷蛋白亚基Glu-A3基因的分离和鉴定

低分子量麦谷蛋白约占小麦种子贮藏蛋白的三分之一,对面团延展性和食品加工品质有重要影响。普通小麦近缘种是小麦遗传改良的重要基因资源。本研究利用Glu-A3位点特异性引物对野生二粒小麦、栽培二粒小麦、硬粒小麦及野生一粒小麦共计9份材料进行Glu A3-1、Glu A3-2、Glu A3-3基因扩增和鉴定,各发现5个等位变异,共计15个单元型;其中,有2个等位变异含有9个半胱氨酸残基,可能属于优良品质亚基。对小麦近缘种中这些Glu-A3位点等位变异的鉴别,进一步完善了小麦低分子量麦谷蛋白亚基的构成,并为小麦品质育种中亲本的选择提供了相应依据。     

中国小麦微核心种质低分子量麦谷蛋白Glu-A3位点等位基因的PCR检测

低分子量麦谷蛋白在麦谷蛋白中约占75%,对小麦品质具有重要的作用。目前对LMW-GS组成与小麦品质的关系尚无统一的、标准的、综合的结论,中国小麦LMW-GS的分布现状尚很少研究。本研究利用7对低分子量麦谷蛋白Glu-A3位点等位基因的特异引物标记,对200份中国小麦微核心种质的Glu-A3位点的分布状况进行PCR分析,结果表明:中国微核心种质中以c、a、d三个等位亚基的品种数目为多,近一半的品种含Glu-A3c,1/4的品种含Glu-A3a,14.5%的品种含Glu-A3d,三者占总品种数的85%。含Glu-A3b和Glu-A3e的品种各占5%左右,含Glu-A3f的只占1%,因此,对面筋强度作用较大的b、d亚基的数目较少,而对面筋强度作用最小的c亚基却占44.5%。可见通过调整LMW-GS亚基的组成将是改良我国小麦品质的一条重要的途径。     

小麦品种“陕253”低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达

利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1 498 bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912 bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列.经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因,编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,系统演化分析也支持这一结果.构建了该基因的表达载体pET32a-GluD3-S253,在宿主菌E. coll Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白.SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功.     

冬小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基形成时间和积累强度及其与沉降值的关系

采用6个不同品质类型冬小麦品种研究高、低分子量麦谷蛋白亚基形成时间和积累强度及其与沉降值的关系。结果表明, 在籽粒形成过程中,各品种的高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）开始形成时间及形成速度不同,低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）B区在花后10 d基本形成;随着籽粒发育,HMW-GS和LMW-GS的类型和积累量都逐渐增多。强筋小麦     

Allelic variation at the storage protein loci of 55 US-grown white wheats

Fifty soft white and hard white wheat cultivars (Triticum aestivum L.), and five club wheat cultivars (T. compactum L.) were partially characterized in terms of their storage protein compositions, i.e. gliadins, and high molecular weight and low molecular weight glutenin subunits (HMW-GS and LMW-GS, respectively). At the Glu-1 loci, HMW-GS composition 1,7 + 9,2+ 12 was found to be predominant, being expressed in 11 cultivars out of 55. The most common alleles at the loci coding for gliadins and LMW-GS were found to be Gli-A1/Glu-A3a (43.6%), Gli-B1/Glu-B3b (36.4%), Gli-D1a/Glu-D3a (38.1%) and Gli-Dli/Glu-D3a (21.8%). Two-dimensional fractionation (acid-poly-acrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) × sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)) of reduced and alkylated glutenins revealed that the number and the relative mobility of LMW-GS polypeptides were different from those reported for the corresponding Glu-3 alleles of hard-bread wheat cultivars. This result could account for the different technological properties of soft white wheats compared with hard-bread wheat cultivars, owing to the major impact of LMW-GS on dough quality.     

The use of low molecular weight glutenin subunits to distinguish between wheat cultivars with and without resistance to the Russian wheat aphid, Diuraphis noxia

A number of resistance sources for the Russian wheat aphid have been reported in the last few years and were used to develop resistant cultivars from current commercial cultivars in various breeding programmes. It can be diffcult to distinguish between the cultivars with and without resistance without actual infestation and so in this study we looked at low molecular weight glutenin subunits (LMW-GS) of the two groups. Distinctly different banding patterns were found for the cultivars tested and their isogenic counterparts. Although the LMW-GS and DN1 and DN5 are coded on different chromosomes, the LMW-GS are highly repeatable and banding profiles of each cultivar can be used for the identification of unknown seed.     

对基因组原位杂交信号释译可能出现的片面性——来自一个小麦易位系(A-3)中外源遗传物质鉴定的启示

利用基因组原位杂交(GISH)和种子醇溶蛋白电泳(A-PAGE)技术对一个可能携带有10倍体长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum (Host) Liu & Wang)遗传物质的小麦新种质A-3进行了综合鉴定. 用普通小麦"中国春"(Triticum aesticum L. cv. Chinese Spring)基因组(ABD)DNA作探针, 拟鹅观草[Pseudoroegneria stipifolia(Czern e