杏EST-SSR标记的开发

 利用MISA软件对NCBI上杏的15 387条EST序列进行SSR位点查找,发掘出含有SSR位点的序列1 073条,共有1 353个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为8.79%。二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占23.50%、38.80%和23.43%。设计了50对EST-SSR引物并进行PCR扩增,发现40对引物能扩增出理想的PCR 产物,其中有25对引物能够扩增出多态性带。随机对7对引物的部分杏扩增片段进行了测序分析,发现有57.1%的片段具有相应的SSR位点,对梅DNA指纹中部分谱带的测序结果也证明是杏扩增出的相应的SSR位点。根据推算,从杏EST中开发SSR标记的开发效率为3.98%。进一步选用20对扩增效果最好的引物对24个杏品种,16个花梅品种以及8个果梅品种进行DNA指纹构建与遗传多样性分析,结果表明,来源于杏的EST-SSR引物在梅中有很高的通用性,杏和梅是遗传差异明显的两种植物,果梅与花梅在遗传上是不能分为两类的同种植物。     

磁珠富集法分离菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)微卫星标记及系列分析

利用磁珠富集法分离出菠萝蜜微卫星位点,并成功设计出菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.)SSR(简单序列重复,Simple sequence repeat)分子标记引物。基因组DNA经MseI酶切后,用生物素标记的简单重复序列做探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链霉亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的酶切片段被吸附到磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,先用对应的引物扩增,再进行克隆和测序。实验共挑出83个阳性克隆进行测序,成功设计合成SSR引物19对。并通过这19对SSR引物对20份菠萝蜜种质资源进行分析,全部能扩增出特异性条带,其中18对引物扩增的条带具有多态性,可以作为菠萝蜜分子标记使用。     

核桃早实性相关性状的SCAR标记

用RAPD技术对新疆核桃早实特性的分子标记进行了研究。用180个10-mer随机引物分别扩增早实和晚实近等基因池DNA筛选出5个多态性引物,结果只有引物OPG15(5′-ACTGGGACTC-3′)扩增得到1条约710bp的早实核桃特异片段。对该片段进行克隆和序列分析,并根据序列分析结果将该RAPD标记转化为重复性和特异性更好的SCAR标记。研究设计出了1对早实核桃特异SCAR引物P1(5'-ACTGGGACTCCAATTGTATC-3')和P2(5'-ACTGGGACTCTCAACTAT-3'),用这对特异引物对14份材料进行PCR扩增,结果所有晚实核桃材料无任何扩增,但早实材料均扩增出了预期大小759bp的特异带。     

油梨转录组SSR分子标记开发与种质资源亲缘关系分析

选取海南大学油梨种质资源圃的‘Fuerte’油梨花朵和小果进行转录组测序,获得18 010条序列,总长度为29 422 056 bp。利用MISA软件检索转录组测序数据,获得分布于4 687个序列中的6 312个SSR位点。经统计发现,SSR在所检测的序列中出现的频率为35.05%。分析SSR位点特征显示,所有类型的SSR平均长度为18.90 bp,SSR之间的平均距离为4.66 kb。‘Fuerte’油梨转录组中SSR序列以二核苷酸、三核苷酸重复类型为主,两者占SSR总数的87.15%。二、三、四核苷酸重复类型中优势基元分别为AG/CT、AAG/CTT、AAAT/ATTT。利用Primer 3.0对SSR序列设计引物13 398对。以32份油梨种质资源为研究对象,对随机挑选的100对SSR引物进行有效性验证,并用于对这些油梨种质进行亲缘关系分析。发现其中40对引物具良好多态性,共扩增出219条谱带,其中171条为多态性谱带。经计算,平均每对引物产生4.275个多态性片段。He和PIC均值分别为0.529和0.456。UPGMA聚类和PCA分析结果较一致,在系数设定为0.74时可将32...     

基于全基因组序列的马铃薯SSR标记开发与连锁图谱加密

本研究检索了马铃薯全基因组范围内的SSR序列,并分析了其分布特点。通过开发设计位于目标染色体上的SSR引物,对连锁图谱进行加密和低温糖化抗性QTL定位。结果表明,马铃薯基因组上分布着28 609条SSR序列,平均分布于12条染色体上。其中2碱基、3碱基和4碱基基序SSR序列分别有15 943、11 053和1 613条,富含A或T的SSR数分别占2碱基、3碱基和4碱基基序SSR总数的88.6%、45.0%和26.0%。根据SSR序列两侧保守的侧翼序列,设计了位于5号染色体（chr05）上的SSR引物40对,其中有35对能有效扩增,20对引物的目标片段有多态性,13对引物的32个多态性位点定位到chr05上,将平均标记间距从9.0 cM缩小为1.7 cM,低温糖化抗性QTL的2 LOD置信区间从26.0 cM缩小为4.0 cM;6号染色体（chr06）上新设计SSR引物59对,有54对能有效扩增,25对引物的目标片段有多态性,12对引物的30个多态性位点被定位到chr06上,将平均标记间距从5.5 cM缩小为3.5 cM,低温糖化抗性QTL区间从9.0 cM缩小为3.7 cM。研究结果为抗低温糖化QTL的图位克隆奠定了良好基础,为马铃薯抗低温糖化分子育种提供了辅助标记。     

紫薇EST-SSR标记的开发与利用

以紫薇为试材,利用MISA软件对转录组测序获得45 308条unigenes中的SSR特征进行分析。结果表明:9 074条unigenes存在10 905个SSR位点,1 486条unigenes含有2个以上的SSR位点,550个位点是复合重复位点;从7 620个SSRs位点中设计出4 501对SSR引物;随机选择68对SSR引物进行检测,其中61对引物可以成功的扩增出清晰可用的条带,28对引物有多态性。     

洋葱转录组SSR信息分析及其多态性研究

采用生物信息学方法分析洋葱（Allium cepa L.）转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列（SSR）引物,以期为洋葱分子标记辅助育种提供有力工具。利用MISA工具筛选了洋葱转录组测序获得的106 932条unigenes（84.04 Mb）,并对其SSR位点信息进行了分析,共筛选得到5 959个SSR位点（占总unigenes的5.10%）,其发生频率为1/14.1 kb。SSRs位点中主导类型是以AAG/CTT（占总SSRs的10.20%）为主的三核苷酸重复,占总SSRs的37.27%;其次是单、二核苷酸重复,其出现频率分别为30.91%和24.75%。利用Primer5共设计出5 258对SSR引物。随机选择20对引物进行PCR扩增,其中12对扩增出清晰可重复的条带,9对在24个不同类型洋葱材料中表现出多态性。利用UPGMA作图,将24个洋葱材料分为4类。     

甜瓜杂交种SSR指纹图谱的构建

以2个甜瓜杂交品种(系)的种子东方蜜1号和01-31为试材,从63对SSR引物中筛选出10对扩增产物具有稳定多态性的引物,这些引物分布在甜瓜整个基因组,每对引物可以检测到2～4个数目不等的多态性片段(allele),共27个多态性片段,平均为2.7个,片段大小介于85￣270bp之间,并从入选的10对SSR引物中选出7对构建了这2个甜瓜杂交种的指纹图谱。在比较分析各试材图谱的基础上,探讨了品种指纹图谱的统计学方法,并对构建的2个甜瓜杂交种的指纹图谱进行了可信度分析,建立了适于种子检验中使用的标准SSR标记指纹图谱。实验表明,利用SSR技术进行甜瓜杂交种的纯度鉴定是可行的、有效的。     

鸟巢蕨转录组高通量测序及分析

采用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq 2000对鸟巢蕨转录组（Asplenium nidus）进行测序,共获得29 254 595个序列读取片段（reads）,包含了5 908 586 517个碱基序列（bp）信息。对reads进行序列组装,共获得42 907个单基因簇（Unigene）,平均长度936 bp,序列信息达到了40.16 Mb。数据库中的序列同源性比较表明,24 993个Unigene与其他物种的已知基因具有不同程度的同源性。鸟巢蕨转录组中的Unigene根据GO功能大致可分为细胞组分、分子功能和生物学过程3大类51个分支,其中有大量的Unigene与代谢进程、结合活性、催化活性和细胞进程相关。将Unigene与COG数据库进行比对,根据其功能大致可分为24类。KEGG数据库作为参考,依据代谢途径可将Unigene定位到116个代谢途径分支。SSR位点查找发现,从42 907个Unigene中共找到6 067个SSR位点。SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的为AG/CT,其次是AC/GT、A/T和AGG/CCT。针对这些序列,设计了20对引物进行了扩增效率和多态性检测,其中7对引物在不同蕨类材料中表现出多态性。     

基于SRAP分子标记的24个黑木耳栽培菌株遗传分析

以24个北方地区主栽的黑木耳菌株为材料,采用相关序列扩增多态性SRAP分子标记,对24个黑木耳菌株进行遗传分析。结果表明,从48对引物中筛选出了稳定性好、可重复性高、多态性稳定并能扩增出清晰明亮条带的25对引物,扩增出133条多态性条带,片段大小在0.1～1.5 kb,平均每个引物扩增出6条多态性条带。基于非加权组平均法(UPGMA)的聚类分析结果表明:遗传相似系数变化范围为0.56～1.0,在遗传相似系数为0.56时,将24个黑木耳菌株划分为2大类群,第一类包括黑山等18个菌株;第二类包括黑29等6个菌株。     

菜薹转录组中SSR信息与可用性分析

利用菜薹转录组分析检测到48 975条unigene（38.17 Mb）序列数据,运用MIcroSAtellite（MISA）工具发现其中具有1 ~ 6个核苷酸重复类型的SSR位点11 879个,SSR位点发生频率为1/3.2 kb（312.5/Mb）。6种SSR位点类型中主要为1 ~ 3个核苷酸重复,占总SSR位点数的99.01%,其中单、二和三核苷酸类型分别为41.11%、28.23%和29.67%。发现重复序列的基序58个,重复次数在5 ~ 23之间,其中出现频率高的基序主要有A/T、AG/CT、AT/AT、AC/GT、AAG/CTT和AGG/CCT。重复序列长度在10 ~ 60 bp之间,大多小于20 bp,大于20 bp的仅有7.9%（938个SSR位点）。设计出676对具有潜在多态性的SSR引物组合,从中随机抽取30对引物进行PCR扩增验证其可用性,发现22对引物在4份菜薹种质中的扩增产物条带清晰稳定,其中12对引物具有多态性。     

韭菜全长转录组SSR信息分析及分子标记开发

利用MISA软件筛选韭菜(Allium tuberosum)全长转录组测序获得的49 876条(大于500 bp)转录本序列(89.44 Mb),共检测出13 111个SSR位点,分布在10 332条转录本中,SSR出现频率为26.29%,平均分布距离为6.82 kb。在搜索的6种SSR位点类型中,1～3个核苷酸重复类型占主要地位,占总SSR位点数的98.74%,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复类型分别为66.55%、12.52%、19.67%。发现重复序列的基序有103个,其中二核苷酸和三核苷酸重复类型中出现频率高的基序有AC/GT(2.54%)、CA/TG(2.29%)、GAA/TTC(1.85%)和AAG/CTT(1.60%)。重复序列的长度在10～289 bp之间,其中小于20 bp的有11 128个(84.88%),大于20 bp的有1 983个(15.12%)。根据这些SSR位点,共设计出3311对SSR引物,在随机选取的208对引物中有164对(78.85%)能进行有效扩增,其中39对引物在24份韭菜种质资源中表现出多态性。利用多态性引物SSR41,鉴定出‘马蔺韭’×...     

山葡萄种质资源SSR遗传多样性分析

对360份山葡萄种质资源进行了遗传多样性分析研究。从245对引物中筛选出18对用于供试材料的SSR扩增;单条引物扩增条带为4~13条,平均9.44条;扩增产物长度介于150~1 000 bp,以200~750 bp的扩增片段居多;18对引物共扩增出170条带,其中多态性条带167条,多态性百分率为98.2%;Shannon’s多样性指数(I)为1.778051。某些品种(系)产生了特有SSR标记带,共5条,占2.95%。     

红江橙实生群体的遗传鉴定及其嵌合机理的初步研究

以红江橙不同类型的基因组DNA为模板,从多对SSR引物中筛选出能鉴别红江橙不同类型的引物,进而对其实生后代进行遗传鉴定,并用ISSR标记、RAPD标记加以验证.结果表明,红江橙各类型的实生后代叶片DNA组扩增后的电泳图谱均与橙型果的类似,而与红肉橙、橘变果的不同;橙型果可能已经分离为性状稳定的黄肉橙型果,而红肉嵌合体、橘变果可能仍为嵌合状态,其L 2层成分均为橙.     

三色堇转录组SSR分析及分子标记开发

为解决三色堇(Viola×wittrockiana)缺乏共显性DNA标记的问题,利用MISA软件对其转录组测序获得的167 576条unigene进行筛选,共检测出23 791个SSR位点,出现频率为14.20%,平均分布距离为6.75 kb。SSR位点中主导类型为三核苷酸重复,占总SSR的28.31%;其次是二核苷酸重复,占总SSR的12.86%。AG/CT与GAA/TTC分别是二核苷酸与三核苷酸的优势重复基元,分别占总SSR重复类型的4.01%和1.85%。利用Primer 3共设计出6 863对SSR引物。随机选择30对引物进行PCR扩增,其中18对引物可扩增出清晰、可重复条带,并在42份三色堇资源中表现多态性。基于扩增的多态性SSR信息,42份三色堇种质资源的聚类结果与其遗传背景基本一致。本研究中获得的18对SSR引物可为三色堇遗传图谱构建、功能基因定位等提供有力工具。     

基于EST信息的百合SSR标记的建立

依据已知的百合EST（expressed sequence tags）序列信息,开发新的SSR(simple sequence repeats)标记,在NCBI的EST数据库1 688 EST中检索到98条含有101个SSR的序列, SSR的检出率为5.98%,其中三核苷酸重复类型占主导地位,出现频率为2.84%。EST-SSR的重复基元共搜索到47种,其中三核苷酸重复基元类型最为丰富,大约占重复基元类型总数的一半。利用部分EST-SSRs序列共设计23对SSR引物, 以铁炮百合‘Snow Queen' DNA为模板,对引物进行筛选,其中18对引物有扩增产物,占所设计引物总数的78.26%;进一步用这些引物在5个杂种系列13个百合品种进行多态性测试,显示多态性的引物占可扩增引物的66.7%。本研究结果证明了基于百合EST信息建立SSR标记是一种有效而又可行的方法。     

ISSR-PCR和链亲和素磁珠吸附法开发白菜SSR引物

  分别利用ISSR-PCR和链亲和素磁珠吸附法分离白菜基因组微卫星, 共得到41对SSR引物。ISSR-PCR法运用巢式PCR, 分别设计微卫星两侧引物IP₂ 和IP₃ , SSR引物得率为12%。磁珠吸附法首先利用生物素标记的SSR探针与文库杂交, 链亲和素磁珠吸附富集含SSR的片段。然后用接头引物扩增, 克隆。根据测序结果, 设计SSR两侧引物PL 和PR, 引物得率为9.6%。     

利用黄秋葵转录组信息挖掘SSR标记及用于种质分析

通过对黄秋葵（Hibiscus esculentus L.）转录组信息分析,共获得74 600条unigene,全部序列有52 976 011 bp;有3 191条unigene包含SSR的序列,从中鉴定出3 448个SSR位点,其中有235条序列包含1个以上SSR,复合SSR有123个。优势重复基序为三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR的60.79%和21.43%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元,占总位点的11.02%,三核苷酸重复基元以AGA/TCT为主,占总位点的19.61%。利用Primer 3.0共设计出8 088对SSR引物。从87对有效扩增引物中随机选择60对用于32份黄秋葵种质的多态性验证分析,其中36对（占60%）引物表现稳定可重复的多态性。利用UPGMA作图,将32份供试材料分为2类。利用黄秋葵转录组数据进行SSR标记开发,能获得较高频率的SSR位点,且类型丰富,为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。