抑制性差减杂交技术(SSH)在植物学研究中的应用

抑制性差减杂交是一种基于转录水平的杂交技术,能将差异表达基因扩增千倍后富集,具有高效、灵敏、操作简单,假阳性率低等特点,已经越来越多的被应用在植物学研究领域。就该技术的原理、特点及其在植物学方面的应用研究进展作一简要介绍。     

抑制性差减杂交(SSH)技术在分离植物差异表达基因中的应用

抑制性差减杂交技术（SSH）是基于抑制PCR作用的cDNA差减杂交，是在转录水平上研究差异基因表达的技术。该技术在一个循环过程中完成差异表达基因丰度的均等化及目标群体和对照群体中相同基因的去除，从而实现差异表达基因的高度富集。一个典型的SSH过程，可在一个差减杂交过程中将稀有基因序列富集上千倍。本文通过详细分析该技术在植物差异表达基因分离中的应用发现：SSH技术主要用于分离组织特异性表达和诱导型表达的基因。首先，SSH技术广泛应用在分离植物发育过程中不同发育阶段和不同组织器官中的组织特异性表达的基因，为揭示植物生长发育过程的分子机理提供了有效手段；另外，在不同植物中，该技术被大量应用于分离各种生物及非生物胁迫条件下诱导表达的抗性相关基因，可以揭示植物抗逆的分子机理。目前，SSH技术己开始应用于分离与次生代谢产物合成相关的基因。SSH技术是分离植物差异表达基因，揭示植物复杂生命现象分子机理的有效方法，将在植物差异表达基因研究中得到更广泛的应用。     

应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌4型菌株可能毒力基因

为了寻找副猪嗜血杆菌可能毒力基因,采用抑制性差减杂交技术,以HPS有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)为研究对象,构建差减杂交文库,利用Southern Blot分析和PCR鉴定进行差异基因片段的筛选。从构建的文库中共筛选得到7个特异性差异基因片段,经同源性分析,其中5个片段分别与噬菌体重组蛋白、糖基转移酶/荚膜多糖磷酸转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、核糖体蛋白丙氨酸转移酶和ABC型硝酸盐/磺酸盐/碳酸氢盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性;2个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关。利用PCR对上述可能与毒力相关的差异基因片段在9种不同血清型HPS中的分布进行了检测,结果表明,7个片段存在于多数的有毒力菌株(血清4,5,12,14,15型)中,而在无毒力菌株(血清3,11型)中均未检测到。利用SSH技术成功构建了HPS有毒力菌株SW124和无毒力菌株H465的差异表达基因差减文库,筛选获得了7个差异基因片段,且上述片段在HPS不同血清型有毒力菌株中分布广泛。     

抑制性减法杂交技术及其应用

本文介绍了抑制性减法杂交技术的原理和方法，并列举了实际的应用案例。     

香蕉果实采后抑制差减文库的构建与鉴定

抑制差减杂交技术(suppression subtracfive hybridization,SSH),是抑制PCR与差减杂交技术相结合而产生的。其优点是在差减杂交过程中使不同丰度cDNA的拷贝数差异趋于均衡,因此不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆,能有效分离低丰度的差异表达基因,避免了表达序列标签分析中高丰度基因重复测序的缺点。因此SSH技术被应用于植物差异表达基因的分离。香蕉果实采后成熟过程中发生一系列复杂的生理变化,这些变化涉及到许多基因的表达。为了研究香蕉果实采后与采前在基因表达上的差异,我们首次采用抑制缩减文库的方法,以分离香蕉果实在采后表达的基因。以采后0h的香蕉果实cDNA为驱动子,对香蕉果实采后48h果实cDNA为待测子,进行抑制缩减杂交,抑制缩减杂交产物与pGEM—TEasy Vecter连接,转化E．coli DH5α,构建了抑制缩减文库。该文库共包含312个克隆,采用PCR方法对文库进行了重组子的鉴定,共有302个重组子。该文库的构建成功为深入研究香蕉果实采后基因的表达奠定了基础,为研究香蕉果实采后成熟的分子生物学机理提供了一个新的思路。     

富集小麦磷胁迫响应基因的cDNA差减文库构建和部分ESTs的功能鉴定

植物在形态学和生化代谢水平上对低磷胁迫逆境的响应,是特异表达基因在时空上精细协同作用的结果.以前期工作中鉴定的磷高效小麦品种石新828为材料.构建了富集不同低磷处理时间点特异表达基因的根系cDNA差减抑制杂交文库.获得的克隆总数为2 682个.对随机选取的文库克隆研究发现,克隆中插入的片段长度为250～750 bp.测序结果和功能比对发现,具有功能比对结果的克隆比例为70%,其中部分分别与小麦、大麦、水稻、玉米和拟南芥等植物种属高度同源,参与转录调控、蛋白质合成和代谢等多个生物学过程.该富集低磷胁迫响应基因文库为进一步鉴定小麦响应磷胁迫逆境的基因调控网络和克隆重要的磷高效相关基因奠定了坚实的基础.     

细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉苗基因表达差减文库的构建及EST分析

利用细极链格孢菌蛋白激发子粗提蛋白液诱导棉花苗期相关基因表达,以清水喷施为对照样本,进行抑制差减杂交,构建棉花苗期基因表达文库.结果显示,插入片段的大小主要集中在200～1000 bp.随机选取150个克隆进行菌液PCR检测与测序,并将所测序列与Gen-Bank dbEST库进行比对,共得到104个单一序列.其中,78个EST与其它物种已知基因部分区域的同源性为48.54%～100%,占总EST的75%;6条EST序列能在数据库中检索到同源性序列,但其功能尚不清楚,占5.77%;10个EST能在数据库中发现为推测蛋白,占9.6%;10个EST在GenBank中没有查到对应的同源序列,可能是新基因,占9.6%.同时,将所得到的104条EST序列在WEGO网站上进行功能分类,通过Gene ontology确定具体EST的分子功能.其中,在生物途径分类中,与生理途径和细胞过程相关的EST最多,分别为48个和45个;在细胞组份功能分类中,与细胞相关的EST最多,达到44个;在分子功能分类中,催化功能与分子绑定相关的EST数量最多,分别达到了30个和28个.由此可见,细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉苗时涉及到植物的生理生化的多条途径,受到多个基因的调控,可能包括抗病与防御蛋白、信号传导蛋白、转录因子、能量代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白、细胞保护机制蛋白、功能未知及其它蛋白等相关蛋白.     

杉木木质化过程特异表达基因文库的构建与分析

研究木质部木质化过程及其生物学特性对于了解木本植物水分和矿物质的吸收及运输机制、木材形成的遗传控制、改良材性及提高木材生长量具有十分重要的意义。为了获得杉木木质化过程中特异表达的基因,本研究利用抑制差减杂交技术,以杉木突变体独干杉无性系为测试方(Tester),正常的句容0号无性系为驱动方(Driver),构建了正向和反向两个差减文库,分别获得了618和409个克隆。利用通用引物T7和SP6进行PCR及EcoRⅠ酶切鉴定文库重组子,结果证明所构建的文库符合要求,具有代表性。该文库的成功构建为获得杉木木质化过程中特异表达的基因及深入了解木本植物木质化的机理奠定了基础。     

斜纹夜蛾取食诱导棉花抑制性消减文库的初步构建及生物信息学分析

 为了筛选棉花抗逆基因,实验室构建了棉花被斜纹夜蛾幼虫取食诱导的正、反向抑制性消减文库。文库随机各挑取1000个克隆进行PCR鉴定,发现插入片段长度主要集中在200~1000 bp之间。经反向Northern杂交筛选,正向文库随机挑取250个克隆测序,得到了35条非重复序列ESTs,反向挑取150个克隆,得到24条ESTs。GenBank数据库BLAST序列相似性比对功能分析表明,斜纹夜蛾幼虫取食胁迫棉花的应答过程涉及信号传导、基因调控、抗胁迫、防御反应、能量合成代谢、细胞生长延伸等多个生物途径。诱导表达的基因对斜纹夜蛾取食胁迫功能表现为一定的直接或间接保护作用。     

利用抑制差减杂交技术分离棕色棉纤维特异表达基因

采用棕色棉新彩棉5号为Tester,其白色近等基因系NIL-C5为Driver,通过抑制差减杂交法(suppressive subtractive hybridization,SSH)构建了一个棕色棉纤维色素差异表达基因差减文库.从文库中随机挑选400个克隆,将这些克隆的PCR产物点膜进行反向Northern杂交检测,挑选20个差异明显的克隆进行序列分析,结果表明:有5个cDNA片段与已知的功能基因序列相似,其中1个cDNA片段与合成色素的重要酶基因4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)基因有较高的同源性,其它cDNA片段在数据库中未找到同源序列.     

利用抑制性消减杂交技术分离草莓抗炭疽病相关基因

利用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）,比较接种炭疽病菌与未接菌草莓之间的基因表达差异,筛选抗草莓炭疽病菌的差异表达基因片段,为草莓抗炭疽病遗传育种提供理论依据。分别提取接种草莓与未接种草莓叶片的总RNA,分离mRNA,逆转录成cDNA,利用Rsa I进行酶切,然后以接种叶片酶切cDNA为试验方（tester）,以未接菌草莓叶片酶切cDNA为驱动方（driver）,构建了草莓抗炭疽病基因消减文库。菌落PCR结果表明,插入片段大部分在100~1000 bp之间,文库质量好。对文库中1500个阳性克隆进行测序,共得到了1377个有效的ESTs序列。利用NCBI数据库进行Blast同源性比较发现,这些ESTs可能与胁迫反应、信号转导、蛋白合成、蛋白相互作用、物质代谢、跨膜通道、转录因子、金属转运及未知或假定蛋白等有关,ESTs序列的获得为后续草莓抗炭疽病相关基因的克隆、表达和转基因研究提供了参考。     

基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记

分别以二倍体长穗偃麦草和普通小麦中国春的基因组DNA作实验组和对照组,运用抑制消减杂交(SSH)技术去除2个基因组DNA之间的同源序列, 获得长穗偃麦草特异的DNA片段构建的单向抑制消减文库,并对随机克隆测序。根据测序结果设计引物,获得36个长穗偃麦草基因组特异分子标记,成功率高达69.2%。这些标记均能在具有长穗偃麦草E染色体的不同小麦背景和不同世代中稳定表现,可用于小麦背景中跟踪长穗偃麦草染色体或片段。     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础。试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(EDTA-Fe2＋,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2＋,40 μmol/L)的根的总RNA,经过LD-PCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库。用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300~800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果。     

干旱胁迫下斑茅消减文库的构建及分析

以干旱胁迫下斑茅(Saccharum arundinaceum Retz.)叶片组织的cDNA为Tester，正常生长条件下斑茅叶片组织cDNA为Driver，利用抑制性消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）构建斑茅干旱胁迫消减文库。文库克隆总量约为30 000个，克隆重组率为99.2%；随机从文库中挑取3500个克隆分析表明，插入片断长度主要集中在200~1 000 bp之间，500 bp以上的有463个克隆，500 bp以下的有3 037个克隆，平均长度约450 bp; 通过随机对16个文库阳性克隆的测序及分析，3个克隆与ATP-NAD kinase、Aldo/keto reductase和锌指蛋白高度同源，3个克隆没有同源性，10个与逆境相关，是功能未知的EST。选择编号为EL0149和EL0145两个克隆进行Northern杂交验证，结果表明EL0149克隆为干旱胁迫上调表达的EST序列，而EL0145在正常供水和干旱条件下均无明显的的杂交信号。说明本研究克隆的SSH文库质量较高，可以进一步利用SSH文库结合芯片表达谱分析解析作物水分胁迫下的相关抗旱基因网络。