水稻核糖体蛋白基因OsRPL2的克隆、序列分析及表达载体构建

依据鉴定得到的水稻(Oryza sativa L.)核糖体蛋白质Os RPL2的序列设计了引物,从水稻叶片的c DNA中扩增得到目的片段。并对目的基因序列进行了测序鉴定和序列分析,同时在大肠杆菌中构建水稻核糖体蛋白质基因Os RPL2的原核表达载体p GEX-4T1-RPL2,转化入BL21(DE3)后利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。结果表明,成功扩增出了水稻核糖体蛋白质基因Os RPL2的c DNA序列,大小为1 570 bp,其编码的蛋白质含有502个氨基酸。根据序列分析的结果,水稻Os RPL2基因与多个植物核糖体蛋白质L2基因具有较高的相似性,并且其编码的Os RPL2蛋白质具有2个与核糖体蛋白质功能相关的功能域。在此基础上,构建了具有p GEX-4T1-RPL2重组子,诱导表达后,纯化得到了带有GST标签的可溶性Os RPL2蛋白质。     

木聚糖酶基因umxyn10B的克隆与表达研究

从富集培养物宏基因组文库中筛选获得1个表达木聚糖酶活性的克隆pXYN12.鉴定分析表明:pXYN12上潜在的木聚糖酶基因umxyn10B大小为999 bp.编码产物与嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophi-lus)的木聚糖酶基因(GenBank索引号AAZ74783)的氨基酸序列有63%的一致性和76%的相似性,属于糖基水解酶家族10的成员.PCR扩增了umxyn10B的含催化功能域编码区的DNA序列并连接到表达载体pET-30a(+)上,构建成表达质粒在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中实现了表达,并对表达条件进行研究.     

EPSPS基因的克隆及油用亚麻表达载体的构建

以抗草甘膦油菜基因组DNA为模板,PCR扩增抗草甘膦油菜的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因,构建植物表达载体pBI121-EPSPS,并导入农杆菌进行检测.结果表明:扩增获得EPSPS基因全长1 377bp,共编码459个氨基酸.测序结果表明,其与美国Monsanto公司获得的专利(US5633435)中已知的CDS序列完全一致,表明成功构建了EPSPS植物表达载体,并将其导入农杆菌菌株LBA4404中.     

蒺藜苜蓿二氢黄酮还原酶基因克隆及植物表达载体构建

采用RT-PCR方法,从蒺藜苜蓿(Medicargotrunctula)中克隆了二氢黄酮还原酶(DFR)基因cDNA片段,并进行DFR基因植物表达载体的构建.结果表明:扩增的DFR基因片段全长约1 000 bp,编码337个氨基酸,与Gen-Bank中已注册的DFR基因核苷酸序列的同源性为99.80%.以pBI121为基础载体,构建了CaMV35S启动子驱动的DFR基因的植物表达载体pBIDFR,然后导入农杆菌EHA105,经PCR验证确定构建出植物表达载体.     

笃斯越橘花青苷途径中CHS基因的克隆与序列分析

以笃斯越橘花朵为试材,根据兔眼蓝莓查尔酮合成酶(VaCHS)mRNA全长序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增出长度大约为1 400bp目的片段,经测序,结果表明,笃斯越橘CHS基因(VuCHS)cDNA序列全长1 391bp,包含1 170bp开放阅读框(ORF),编码389个氨基酸,将笃斯越橘CHS基因(VuCHS)编码的蛋白质与其他来源的查尔酮合成酶蛋白的氨基酸序列进行比对,发现与兔眼蓝莓、杜鹃花和猕猴桃的一致性分别为99%、93%和93%,该基因蛋白质的氨基酸序列与其他植物CHS基因蛋白质的氨基酸序列进化分析表明,与兔眼蓝莓和猕猴桃属于同一分支,与兔眼蓝莓亲缘关系最近。     

不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其原核表达载体构建

参照拟南芥APX基因保守域序列设计引物,扩增出不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的核心片段,结合RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,利用DNAman软件经序列拼接获得1个全长为1 089bp的cDNA序列,该序列包括开放阅读框867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质等电点5.52的相对分子量31 600。APX基因编码的氨基酸序列与拟南芥APX基因编码的氨基酸的同源性为81%。将APX基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白质的表达,SDS-PAGE电泳结果表明,产生了预期大小的重组蛋白。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因的克隆及植物表达载体构建

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是革兰氏阴性细菌致病过程中的关键信号分子,芽孢杆菌中广泛存在的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。利用PCR方法从苏云金芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA的同源性为89%～97%。将该基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了aiiA基因的植物表达载体pCAM-aiiA,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达

采用5对引物组合经2轮PCR扩增对苏云金芽孢杆菌QL75-2菌株中的cry基因进行鉴定,克隆得到1个cry1Da型基因片段。通过设计全长引物扩增得到该cry基因的全长序列,转入原核表达载体pET-28a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,最后对表达蛋白进行生物活性分析。序列分析结果表明,该cry1Da基因全长3 495 bp,推测其编码1 164个氨基酸,组成分子量约132.01 ku的蛋白质。该预测蛋白质与已知的Cry1Da3蛋白质具有最高的序列同源性(99.7%),该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Da5。生物活性分析结果表明,Cry1Da5蛋白质对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有较强的杀虫活性,其LC₅₀为21.47μg/mL,而对鳞翅目的棉铃虫幼虫无杀虫活性。因此,cry1Da5基因可作为一个新的cry基因资源在甜菜夜蛾的生物防治中应用。     

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建

为了克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)的编码基因以用于表达载体的构建,本研究根据已公开的序列信息设计特异性引物,以玉米自交系ZD410的叶片DNA为模板,通过PCR技术成功克隆了pepc基因的全长序列。生物信息学分析发现,该基因完整ORF长度为2 913 bp,编码蛋白质分子质量约为108.179 ku,等电点(PI)为5.73;对其氨基酸序列进行同源性检索分析显示,该蛋白质与其他C4植物的PEPC蛋白具有极高的同源性;利用Gateway技术构建含pepc目的基因的表达载体,并通过农杆菌介导的花序浸染法将该基因导入野生型拟南芥。     

猪OLR1基因克隆及生物信息学分析

设计猪氧化低密度脂蛋白受体1(OLR1)基因编码区全长引物,从猪脂肪组织中扩增OLR1基因编码区全长序列,对其蛋白质序列进行比对分析,预测蛋白质信号肽位点及结构域并研究该基因密码子使用偏好性。结果表明:猪OLR1基因编码区全长为825 bp,共编码273个氨基酸,猪OLR1基因与牛同源性最高(84%),其次是人(79%)、大鼠(51%)和小鼠(27%)。猪OLR1蛋白38~60位氨基酸为信号肽所在位置,144~256位氨基酸正是C型凝集素家族共有结构域;OLR1基因密码子A U含量(61.2%)远高于G C含量(38.8%),而且偏向使用A/U结尾的密码子(占76.53%),这可能影响到OLR1基因的表达水平。