羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PDNR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建（摘要）（英文）

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PD-NR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。     

牛分枝杆菌RecA基因的克隆与序列分析

以牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Valleelll株染色体DNA为模板,以RecA基因特异性引物进行PCR扩增,获得约240 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出了重组质粒pMDTM18-T-RecA,为进一步研究RecA基因及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.     

副结核分枝杆菌ISMav2基因的克隆与序列分析

以副结核分枝杆菌C-2染色体DNA为模板,以ISMav2基因特异性引物进行PCR扩增,获得约340 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出重组质粒pMDTM18-T-ISMav2,为进一步研究ISMav2基因及其在副结核病诊断中的应用奠定了基础.     

腐蹄病A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与序列分析

以腐蹄病A型节瘤拟杆菌染色体DNA为模板,根据设计的上、下游引物进行PCR反应,扩增出了大小约0.78kb的基因片段,用T4DNA连接酶将PCR产物与pGEM-T-Easy载体连接,构建了重组质粒。并以EcoRV和SalI双酶切重组质粒鉴定目的基因的插入方向。经序列测定,克隆的目的基因片段为Pili基因。     

pBI121表达载体及其转化植株的快速鉴定

    以双元质粒pBI121为基础分别构建正义、反义和RNA干涉(RNAi)植物表达载体根据pBI121质粒多克隆位点两侧的DNA序列设计1对通用引物,以表达栽体的重组质粒DNA为模板进行PCR扩增,使用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切PCR产物以验证扩增条带的真实性,从而可以快速鉴定pBI121表达栽体的重组克隆这种方法也可用于快速鉴定上述表达载体的转基因植株,其检测结果与常规鉴定方法完全一致此外,可以根据需要对表达载体的阳性PCR扩增产物进行测序,测序结果能够精确地显示出重组pBI121表达栽体中目的片段的插入方向以及插入序列是否出现碱基突变本研究为各种pBI121表达载体及其转基因植株的鉴定提供了一种快速、有效的方法     

大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...     

副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆及序列分析

以副结核分枝杆菌C-2株基因组DNA为模板,以hsp65基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1 626 bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体.经鉴定,成功地构建出了重组质粒pGEM-T-hsp65.序列分析结果表明:该序列与GenBank中副结核分枝杆菌K～10株的同源性为99.2%.     

粘虫肠道细菌群落多样性的PCR DGGE指纹图谱分析

研究东方粘虫[ Myth imna se parata (Walker)]肠道细菌的多样性.采用常规分离培养与分子鉴定相结合的方法,并以16S rDNA作为分子标记的变性梯度凝胶电泳(DGGE)对肠道细菌进一步分离,DGGE分离样品是研磨提取粘虫中肠组织DNA、提取培养混合菌DNA及直接以培养混合菌为模板进行PCR扩增的产物.结果表明,共得到DGGE条带19条,其中肠组织研磨提取DNA的DGGE条带最多,为17条;直接以培养混合菌液为模板进行PCR扩增次之,为13条;培养混合菌液提取DNA的条带最少,为12条.传统方法和分子生物学方法相结合研究肠道微生物多样性时能获得更全面的微生物信息,可采用培养混合菌提取DNA再结合其他方法进行后续研究.     

鸡传染性喉气管炎病毒gC基因克隆测序

参考GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gC基因序列设计并合成一对引物,以ILTV河南长葛株DNA为模板,PCR扩增出一条1270bp的特异性条带,并克隆至pGEM—T载体上。经PCR扩增、酶切鉴定,得到含gC基因重组质粒,并对重组阳性质粒进行序列测定,测序结果为1550bp。     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

枯草芽孢杆菌224 yplQ基因敲除及其对溶血性的影响

为了确定枯草芽孢杆菌224(Bacillus subtilis 224,BS224)的溶血基因或引起溶血的主效基因,以枯草芽孢杆菌224基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增yplQ基因上游约1.0 kb和yplQ基因下游0.5 kb两段DNA序列,并以携带新霉素抗性基因的重组质粒pMD18-T-neo为骨架,构建基于yplQ基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yplQ,线性化后电转化至枯草芽孢杆菌224,通过新霉素抗性平板得到36个neor抗性转化子,基因组PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定yplQ18为yplQ基因缺失菌株,将其接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,仍能引起溶血。结果表明,单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体上yplQ基因对菌株的溶血性无影响或影响不大。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表达载体的构建

从黑曲霉(Aspergillus niger)GI M3.452中克隆得到木聚糖酶基因xynA的成熟肽编码序列。通过重叠延伸PCR将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段和猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽进行拼接得到融合片段SPA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-SPA,重组质粒经过酶切、测序鉴定其读码框的正确性,在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-SPA转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测到木聚糖酶活性为7.6I U/mL。     

犬冠状病毒部分纤突蛋白基因的分子克隆

以RT－PCR方法扩增出犬冠状病毒（CCV）YS1、CI1 2株国内分离病毒的部分纤突蛋白基因，经酶切鉴定为CCV特异性核苷酸片段。采用平端连接法将Wizard^TM PCR纯化试剂盒纯化的PCR产物克隆于pUC19 Sma I酶切位点上，获得YS1pUC19、CI1pUC19重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定表明：重组质粒大于蓝斑菌质粒。以BamHI、Kpn I双酶切重组质粒可获得比原PCR产物略大的核苷酸片段，并从中以PCR方法扩增出与原PCR产物大小相同的核苷酸片段。     

应激诱导木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中表达

克隆含有信号肽碱性木聚糖酶基因(xynA)片段与依赖转录起始因子σB的启动子PgsiB片段,将其克隆至实验室前期构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体上,并转化入枯草芽孢杆菌WB700菌株,获得重组菌BXS-W.当细菌生长至对数期中期时,施加不同的应激处理,采用DNS法测定木聚糖酶活性.结果显示,获得了xynA与PgsiB片段;成功构建表达载体pBXS,并获得重组菌株BXS-W;应激试验表明,施加的5种应激条件均极显著提高(P＜0.01)木聚糖酶基因的表达量,其中以乙醇应激效果最好.     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。     

猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立

用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。     

水貂生长激素基因重组腺病毒的构建

本研究利用AdEasyTMXL腺病毒载体系统构建了水貂生长激素基因重组腺病毒。利用PCR、酶切、凝胶回收等方法,从质粒pCMVmGH中获得水貂生长激素基因(mGH),构建穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH。pShuttle-CMV-mGH经PmeⅠ酶切线性化后转化至BJ5183感受态大肠杆菌内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH。重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞。PacⅠ酶切结果表明质粒重组成功。转染第10天,细胞出现圆缩、死亡、漂浮等典型病变,透射电镜检测到重组病毒。TCID50测得第2代重组病毒的滴度达到10-7.89/0.1ml。RT-PCR结果证实,重组病毒能够正确转录目的基因。结果表明本试验成功构建了水貂生长激素基因重组腺病毒,为水貂促生长的研究提供了新的科学手段。