用原位杂交检测基因枪轰击小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠体内分布规律

将小鹅瘟病毒(Goose Parvovims,GPV)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别按每只6、3、1μg的剂量基因枪轰击免疫4周龄BALB/c小鼠,于免疫后不同时间采集小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠、脑和免疫部位皮肤等组织,用原位杂交方法检测pcDNA-GPV-VF3在小鼠体内的分布规律.结果显示,pcDNA-GPV-VP3在免疫后1 h即分布于小鼠除脑外各个组织,脑组织于免疫后3 h呈阳性,各组织阳性信号随时间的推移逐渐减弱;pcDNA-GPV-VP3在不同组织中持续时间依次为肝脏>心>脾>免疫部位>肾、肠>肺>脑;pcDNA-GPV-VF3不同剂量组信号强弱和持续时间存在的总体规律依次为6μg组>3 μg组>1μg组.基因枪轰击pcDNA-GPV-VP3于免疫后能快速而广泛的分布于小鼠各个组织且持续存在达63 d.     

不同剂量小鹅瘟病毒VP3基因疫苗肌肉注射诱导小鼠细胞免疫

将小鹅瘟(Gosling plagne,GP)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别按每只50、100、200 μg肌肉注射免疫BALB/c小鼠,以pcDNA3.1( )和生理盐水为对照,于免疫后7、14、21、28、35、63、105 d采血用淋巴细胞转化实验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)分别检测小鼠外周血T淋巴细胞转化效果和CD4 、CD8 T淋巴细胞动态变化.结果表明,pcDNA-GPV-VP3免疫小鼠能够诱导机体产生良好的细胞免疫应答.50、100 μg pcDNA-GPV-VP3免疫后小鼠外周血T淋巴细胞对ConA刺激的反应显著或极显著高于200 μg组、空载体和生理盐水对照组,且以100 μg组最优,而200 μg组的转化效果比空载体组差;100 μg pcDNA-GPV-VP3免疫小鼠后所诱导的CD4 T淋巴细胞免疫功能最强,50 μg组次之;50 μg pcDNA-GPV-VP3免疫小鼠后所诱导的CD8 T淋巴细胞免疫功能最强,100 μg组次之.     

小鹅瘟病毒VP3基因的原核表达

根据GenBank已发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计并合成1对特异性引物,经PCR扩增得到了1 457 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-VP3.经0.1 mmol/L IPTG诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到表达.Western-blot分析表明,该蛋白具有良好的反应原性.为开发相应的基因工程疫苗奠定了理论基础.     

原位杂交检测鹅细小病毒VP3基因方法建立及肌注VP3基因疫苗在小鼠体内的动态分布

将100μgpcDNA-GPV-VP3基因疫苗肌肉注射4周龄BALB/c小鼠,并以生理盐水和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,建立并应用寡核苷酸探针原位杂交方法检测pcDNA-GPV-VP3在免疫小鼠各组织器官(心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、免疫部位肌肉)的动态分布规律。结果表明,所建立的原位杂交方法具有特异性强、敏感性高、定位准确等特点,能检测约13pg的同源DNA。pcDNA-GPV-VP3基因疫苗在肌注后1h可分布到除脑以外的所有组织,肌注后3h脑呈阳性,21d除脑外的其他组织仍呈阳性,105d仍能在肌注部位检测到pcDNA-GPV-VP3;pcD-NA-GPV-VP3在小鼠各组织中持续时间为肌注部位肝脾、心肾肺、肠脑。     

小鹅瘟病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法扩增GPV VP1基因173 bp的基因片段,克隆到PMD18-T载体上,将纯化后的质粒做为模板,建立扩增反应的标准曲线,最终建立了小鹅瘟病毒(GPV)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏性高,可检测2×101拷贝/μL的模板量;特异性好,与鹅副黏病毒、鹅流感病毒、鹅源鸭瘟病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、曲霉菌均不发生交叉反应。建立的GPV荧光定量PCR具有特异性好、敏感度高、检测时间短、结果重复性好等优点,可用于小鹅瘟的临床诊断和流行病学调查。     

霍尔多巴吉鹅源小鹅瘟病毒VP3基因的克隆及序列分析

采用聚合酶链式反应(PCR)方法对国内霍尔多巴吉鹅源小鹅瘟病毒分离株(GPV-H)的结构蛋白VP3基因进行扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序.结果表明,GPV-H株VP3的核苷酸序列全长1 605 bp,编码534个氨基酸,与GenBank发表的13株小鹅瘟病毒VP3相比,核苷酸同源性在92.5％～98.9％之间.通过基因进化树分析可以看出,GPV-H株与波兰和匈牙利分离到的5株病毒亲缘关系较近.     

小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析

试验利用PCR技术从自行分离的GPV基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,提取重组质粒经PCR和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,VP3基因全长1605 bp,编码534个氨基酸;分子生物学分析表明所分离到的病毒为强毒株。     

小鹅瘟套式PCR诊断方法的建立及初步应用

本试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计了两对VP3基因的特异性引物,进行PCR扩增,建立了小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法,该方法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带。本方法对病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为0.02175 fg/μL。通过对延边地区疑似小鹅瘟的80只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为95%。结果表明,本试验建立的小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法具有极高的敏感性和特异性且检出率极高,可作为一种有效的临床诊断方法。     

鸭甲肝病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在雏鸭体内分布规律

为研究鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)在雏鸭体内的动态分布情况,本研究建立了检测DHAV-3的Taqman荧光定量PCR方法,该方法在107~102范围内有良好的线性关系,相关系数0.997,检测下限为22copies/PCR。将200只2日龄雏鸭随机分为4组,依次对每组雏鸭肌肉注射0.2ELD_(50)、2ELD_(50)、20ELD50的DHAV-3(SD1201株)和生理盐水,并于感染后1、2、6、12、18、24、36、48、72、96h从各组分别随机取3只雏鸭,应用荧光定量PCR方法对其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊的病毒含量进行检测。结果表明,DHAV-3于感染后1h即可在3个试验组雏鸭肝脏中检测到,病毒含量为102~103 copies/g,2h后在心脏、脾脏、肾脏、胸腺和法氏囊中均检测到该病毒。各器官中的病毒含量于感染后36~48h达到高峰期,至72h病毒含量仍维持稳定。此外,在整个感染过程中,被检器官中的病毒含量与初始感染剂量呈正相关。本研究结果有助于阐明DHAV-3的致病机理。     

禽流感病毒NS基因荧光定量PCR检测方法的建立

禽流感病毒(AIV)属于正黏病毒科中的A型流感病毒属,被世界动物卫生组织定为A类传染病.目前在全球范围内暴发的H5N1亚型AIV给养禽业造成了巨大损失,同时还严重威胁人类健康.据WHO最新数据显示,我国已报道人感染禽流感30例,其中20例死亡[1].     

不同剂量猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗肌肉注射诱导仔猪细胞免疫的研究

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因疫苗(pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5)分别以200 ug,100 ug和50 ug 3种剂量肌肉注射免疫21日龄仔猪,同时设空载体对照和生理盐水空白对照.于免疫后7 d、15d、30d、45d、60d和70d采用流式细胞仪(FACS)和淋巴细胞增殖试验(MTT法)分别对免疫猪外周血中CIM+、CD8+T淋巴细胞数和淋巴细胞的转化功能进行检测.结果表明3个不同剂量的pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5基因疫苗免疫仔猪后均能诱导产生良好的细胞免疫应答,实验组与对照组比较差异极显著(p<0.01)或显著(p<0.05).大剂量基因疫苗免疫仔猪的外周血T淋巴细胞的增殖能力及CD4+、CD8+百分含量高于中剂量和小剂量基因疫苗免疫的仔猪,表现出一定的量效关系.     

禽流感DNA疫苗重组质粒组织分布的实时荧光定量PCR方法建立

为研究禽流感病毒(AIV)DNA疫苗重组质粒在组织中的分布情况,本研究以AIV DNA疫苗pCAGGoptiHA 5HA基因为检测对象,分别建立检测AIV DNA疫苗重组质粒的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法和TaqMan MGB实时定量PCR方法。经优化比较两种方法的特异性、敏感性、重复性和污染率。结果表明,两种方法的标准曲线线性关系均较好,相关系数均达到0.999;最低检测量为42 copies,特异性强;探针法的重复性优于染料法,污染率低于染料法,因此采用TaqMan MGB实时定量PCR方法检测AIV DNA疫苗重组质粒组织分布情况。     

Surgical resolution of accidental intramuscular injection of Gudair® vaccine in a mare

This case report describes the accidental intramuscular administration of 20 mL Gudair® vaccine to a 7‐year‐old Standardbred mare and successful treatment of the resulting inflammatory reaction by radical surgical resection.     

牛卵形巴贝斯虫不同靶基因PCR检测方法的比较

旨在筛选出检测牛卵形巴贝斯虫特异、敏感的PCR方法。本试验以牛卵形巴贝斯虫18S rRNA、AMA-1和CCTη基因为靶基因进行PCR检测,从敏感性、特异性和临床检出率方面进行比较。结果显示,以18S rRNA基因的PCR方法敏感性最高,最小检出率为16 fg/μL;以CCTη为靶基因的PCR方法敏感性最低,检测量为1.6 pg/μL;而以顶膜抗原(AMA-1)为靶基因的PCR方法的最低检测量为160 fg/μL。三种靶基因均扩增不出牛瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫基因片段。通过60份临床血液样本的检测结果表明,以18S rRNA基因设计引物的检出率最高,为30%(18/60),明显高于以AMA-1基因25%(15/60)和CCTη基因21.67%(13/60)。本试验为卵形巴贝斯虫病的诊断提供了更为敏感、特异的检测技术。     

猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和Taq Man MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法.使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线.其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1个EID50,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%和0.65%,除SIV外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%,该方法特异性强、重复性好,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法.