白来航鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.     

鸡白细胞介素15基因的克隆及序列分析

根据GenBank中所收录的鸡白细胞介素15(ChIL 15)的cDNA序列设计特异性引物,以经ConA刺激3 h的科宝鸡脾脏淋巴细胞的总RNA 为模板,用RT PCR 方法克隆获得了ChIL 15的cDNA。ChIL 15的cD NA全长655 bp,其中第84 位~644 位是该基因的阅读框(ORF),共编码187 个氨基酸。将所克隆的序列与已报道序列相比较,二者核苷酸的同源性为100%(655/655),所编码蛋白质的氨基酸序列同源性也为100%。     

编码鸡IL-18成熟蛋白基因的分子克隆与序列测定

白细胞介素18（IL-18）是一种能诱导IFN-γ产生的新型细胞因子，在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用，本研究根据已发表的鸡白介素18（IL-18）cDNA基因序列设计引物，用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术从有丝分裂原ConA刺激48小时活化的白来航鸡脾细胞中扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白质的基因。并进行序列测定。并与结果进行了比较。发现本研究克隆到的鸡IL-18成熟蛋白编码基因序列在482位为C，而Schnieder等报道的序列为T，这一核苷酸序列的变化导致了推导的对应氨基酸残基由苯丙氨酸变为丝氨酸。该处碱基变化的原因究竟是鸡 IL-18本身存在多态性，还是反转录或PCR过程中的碱基错配所致，该处碱基的变化对于鸡IL-18蛋白的表达及其生物活性究竟有无影响等问题正在研究中，该基因为国内首次报道经序列测定证实的鸡IL-18基因，为进一步体外表达鸡IL-18蛋白并深入研究其功能奠定了基础。     

堆型艾美耳球虫子孢子表面抗原基因cSZ1的克隆及序列分析

根据已报道的堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计特异性引物,以孢子化12h的E.acervulina广东株卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法成功克隆了其子孢子表面抗原基因cSZ1(cSZ1(Gd))的cDNA。所克隆cSZ1(Gd)的cDNA全长940bp,其中第3～512位是其阅读框架,共编码170个氨基酸,两端为非编码区。与已报道的cSZ1基因的cDNA序列相比,cSZ1(Gd)有4个位置的核苷酸发生了变异,即原序列中第294、443、569、586位的G、G、G、A在cSZ1(Gd)分别为A、A、A、G,二者核苷酸序列的同源性为99.57％(936/940),其中阅读框架的核苷酸同源性为99.61%(508/510)。比较根据核苷酸序列推导的氨基酸序列,第294位的变异导致了所编码氨基酸由缬氨酸(V)变为异亮氨酸(Ⅰ),而第443位的变异则为无义突变,氨基酸序列的同源性为99.41％(169/170)。     

鸡白细胞介素-17基因的克隆和序列分析

根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17（ChIL-17）基因的cDNA序列设计了1对特异性引物，以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp，其中第2～508位是该基因的阅读框（ORF），共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较，二者核苷酸序列的同源性为99．6％（722／725），共有3个碱基发生变异，其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为100％。同时，以鸡脾淋巴细胞DNA为模板，用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列，经序列分析，其序列全长1934bp，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子分别位于第2～27、569～815和1484～1720bp处。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒A66弱毒株全基因组分子克隆及序列分析

采用RT-PCR法对Ⅰ型DHV A66弱毒株基因组全序列进行了分子克隆与测序.研究结果表明,不含Poly(A)尾巴的A66株的基因组全长为7 704个核苷酸残基,包括626个核苷酸残基的5′端非编码区、6 750个核苷酸残基的开放阅读框和314个核苷酸残基的3′非编码区.应用分子生物学软件将A66株与GenBank公布的其他DHV-Ⅰ全基因序列进行同源性比较分析,结果表明,除了90D和04G两株变异株外,A66株ORF的核苷酸序列与其他各株的同源性在94.3%～99.7%之间,氨基酸序列的同源性在97.3%～99.6%之间,并且A66与C80、JX弱毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高,在99.4%以上,各毒株氨基酸序列同源性比核苷酸同源性略高.Ⅰ型DHV病毒基因组的一级结构高度保守.     

鸭的类似鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析

通过RT—PCR和DNA测序技术，克隆和测定了绍兴麻鸭的一种类似鸡白细胞介素2(IL-2)基因的核苷酸序列，并构建了该基因编码蛋白的三维结构分子模型。结果显示，绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因的核苷酸长度由748个碱基组成，编码产物为由140个氨基酸残基组成的多肽，编码产物中含有21个氨基酸残基组成的信号肽。绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因的核苷酸及编码产物，与鸡和火鸡IL-2的一致性分别为71.4％～72．1％和55．0％～57．9％，与哺乳类等动物IL-2的一致性分别为22．1％～28．8％和14．3％～17．1％。对绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因蛋白编码产物的系统进化树分析表明，其编码产物与鸡和火鸡IL-2具有较远的亲缘关系。绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因编码产物的三维结构，预测由4个α-螺旋结构和2个β折叠组成。这些研究结果预示。鸭的类似于鸡IL-2基因编码产物，在生物学功能上与哺乳动物和其他禽类具有很大的差异。     

禽流感病毒KMI/99(H9N2)HA和NA基因的序列分析

研究分别以自行设计的一对简并引物和另一对普通引物，经RT－CR，一次性成功地扩增禽流感病毒A／Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2）HA全和基因cDNA和NA全长基因cDNA，并将它们克隆于pGEM-T Easy的T－T窗口，首次报道了该毒株的HA全基因和NA全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列，测序结果显示，该毒株的HA基因全长为1683bp，编码560个氨基酸。NA全长为1398bp，编码466个氨基酸残基。研究发现其HAI羧基端的分子特征是：R－S－S－R。从分子水平推论。A/Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2)属于非高致病力毒株。研究还发现NA蛋白于63－65位缺失了T、E、I三个氨基酸。     

中国白兔白介素-15基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表达

以RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞（PMBCr）进行扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-15基因进行序列比较。结果IL-15基因全长489 bp,编码162个氨基酸,其中前29个氨基酸残基构成信号肽序列。与不同物种IL-15基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异。在推导的中国白兔IL-15氨基酸序列中,在108～110、119～121、127～129和143～146位存在4个潜在的N-联糖基化位点,同时存在6个Cys残基。将pTIL-15双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-15,转化大肠杆菌BL21（DE3）,并用IPTG进行了诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为20 500的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

μ-calpain激活因子UK114的克隆与序列分析

构建了山羊肝脏cDNA文库，采用平板裂解法提取噬菌体DNA，以此为模板用所设计的引物以PCR法扩增出μ-calpain激活蛋白UK114基因，并克隆到pGEM-Teasy载体。序列分析表明，UK114 cDNA包括起始密码子和终止密码子在内全长共计1017bp，5＇非编码区长为39bp，3＇非编码区长为567 bp，编码区长411 bp，编码137个氨基酸序列。与GenBank中Colombo等所得UK114基因比较表明：在5’非编码区，UK114为102 bp，克隆的UK114为39 bp，且二者仅有9个核苷酸序列是相同的；紧接着是起始密码子ATG，然后是一个411bp的阅读框（40nt-450at），编码137个氨基酸，理论分子量约为15ku，二者在编码区仅有1个bp不同，为无义突变；在3’非编码区为552 bp，所克隆的UK114为567 bp，二者在此区域有57个核苷酸序列是不同的：UK114为polyA，所克隆的是不同的核苷酸。二者的同源性为91％，突变的86个核苷酸中都为无义突变，开放阅读框中仅有一个核苷酸突变。     

鸡IL—15基因的分子克隆及其有关特性的研究

实验应用聚合酶链式反应技术从鸡脾淋巴细胞中克隆得到了白细胞介素-15基因，序列分析表明与已发表的鸡白细胞介素-15基因完全一致，核苷酸序列和推导的氨基酸序列与牛的最接近，同源性分别为46%和31%，与哺乳动物白细胞介素-15序列类似，有4个高度保守的半胱氨酸残基，同时本研究也用此方法对鸡脾脏、法氏囊、胸腺、哈德氏腺和盲肠扁桃体等淋巴器官的淋巴细胞中鸡白细胞介素-15mRNA的表达进行了研究，结果表明这些器官的淋巴细胞均表达mRNA。在实验还用有丝分裂原ConA对鸡脾淋巴细胞进行活化，观察活化的淋巴细胞表达白细胞介素-15mRNA的情况，结果发现白细胞介素-15mRNA在活化的脾淋巴细胞中表达量升高。     

犬脾细胞白介素-18(IL-18)基因的克隆与序列分析

为了研究白细胞介素-18(IL-18)的活性和功能，将犬脾细胞经ConA诱导，用TRIzol裂解，提取总RNA，通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出犬IL-18的cDNA，然后连接到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，获得阳性重组质粒。核苷酸序列结果表明，我们得到了长686bp的基因，含有一个582bp的开放阅读框架，编码193个氨基酸。与已知犬序列同源性可高达99．6％，与已知猪序列的同源性为89．8％，所克隆基因为今后进一步研究IL-18基因的功能奠定了基础。     

罗曼鸡胚脾细胞白介素-18基因的克隆与序列分析

根据国外已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18) c DNA基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR技术 ,从鸡新城疫 系病毒接种 4 8h左右的罗曼鸡胚脾细胞中扩增出鸡 IL - 18全基因 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增片段全长 5 94 bp,共编码 198个氨基酸的前体蛋白 ,其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡 IL - 18全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 10 0 % ;序列中编码成熟蛋白的这段基因与国内报道的源自白来航鸡编码 IL- 18成熟蛋白的基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 99.4 %。本研究为鸡 IL - 18的扩增及其他细胞因子的扩增提供了一种简便易行的新方法 ,为进一步研究IL- 18基因的结构、功能、表达及表达产物的应用奠定了良好基础     

鸡IL-2基因的克隆及GST-chIL2融合蛋白的表达

根据Sundick等发表的鸡IL-2基因(chIL2)序列设计合成特异性引物,用RT-PCR从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞扩增出450 bp的目的片段,酶切鉴定及序列测定结果表明为鸡IL-2基因。该基因包括鸡IL-2基因的全部开放阅读框,编码142个氨基酸组成的蛋白质,与GenBank鸡IL-2基因相比,在编码氨基酸的49位有一个氨基酸缺失;而与Broiler、SC、Chenren和Xiaoshan鸡在编码氨基酸上完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel来航鸡、来航SPF鸡、Obese、Silky和Xianju鸡等有1-4个氨基酸的差异;与火鸡和鹌鹑的氨基酸同源性分别为69.9%和59.4%。将克隆到的基因插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-6p-1中,得到重组表达质粒pGEX-IL2。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,表达出了大小约为40 ku的GST-chIL2融合蛋白,其中GST部分为26 ku,鸡IL-2为14 ku,与预期的鸡IL-2成熟蛋白大小一致。     

Cloning and sequence analysis of the complementary DNA for feline preproparathyroid hormone

OBJECTIVES: To clone and sequence the cDNA for feline preproparathyroid hormone (preproPTH) and to compare that sequence with other known parathyroid hormone (PTH) sequences. SAMPLE POPULATION: Parathyroid glands from 1 healthy cat. PROCEDURES: A cDNA library was constructed in lambda phage from feline parathyroid gland mRNA and screened with a radiolabeled canine PTH probe. Positive clones were sequenced, and nucleic acid and deduced amino acid sequences were analyzed and compared with known preproPTH and PTH sequences. RESULTS: Screening of approximately 2 X 10(5) recombinant plaques revealed 3 that hybridized with the canine PTH probe; 2 clones comprised the complete sequence for feline preproPTH. Feline preproPTH cDNA consisted of a 63-base pair (bp) 5'-untranslated region (UTR), a 348-bp coding region, and a 326-bp 3'-UTR. The coding region encoded a 115-amino acid peptide. Mature feline PTH consisted of 84 amino acids. Amino acid sequence analysis revealed that feline PTH was > 83% identical to canine, bovine, swine, equine, human, and macaque PTH and 69, 71, and 44% identical to mouse, rat, and chicken PTH, respectively. Within the region responsible for hormonal activity (amino acids 1 to 34), feline PTH was > 79% identical to other mammalian PTH sequences and 64% identical to the chicken sequence. CONCLUSIONS AND CLINICAL RELEVANCE: The amino acid sequence of PTH is conserved among mammalian species. Knowledge of the cDNA sequence for feline PTH may be useful to investigate disturbances of calcium metabolism and alterations in PTH expression in cats.     

Cloning and sequencing of a bottle-nosed dolphin (Tursiops truncatus) interleukin-4-encoding cDNA.

Using polymerase chain reaction (PCR), a bottle-nosed dolphin (Tursiops truncatus) interleukin-4 (IL4) cDNA was cloned and sequenced. IL4 specific primers were based on the 5' and 3' untranslated regions of the human and murine IL4 gene. The dolphin IL4 cDNA is 528 base pairs in length and contains an open reading frame of 402 nucleotides coding an IL4 precursor of 133 amino acids, with the putative signal peptide of 24 amino acids. Analysis of the mature amino acid sequence shows three potential N-linked glycosylation sites and three disulfide bonds. Comparison of the predicted amino acid sequence shows that dolphin IL4 shares 77, 74, 58 and 41% identity with the bovine, ovine, human and mouse IL4s, respectively.     

Expressed sequence identification and characterization of the cDNA for interleukin-4 from the mitogen-stimulated lymphoid tissue of a marsupial, Macropus eugenii

Very few cytokines that are important to the understanding of T helper cell function are characterized in marsupials. Expression of a 645 bp cDNA product that codes for a predicted Interleukin-4 peptide of 157 amino acids was detected in the lymph node tissues of Macropus eugenii, the tammar wallaby. Using Rapid Amplification of cDNA Ends, both 5'- and 3'-untranslated regions were identified and a polyadenylation signal and three mRNA instability motifs associated with secreted cytokine molecules were also present. The translated cDNA sequence has a putative signal peptide of 24 amino acids, a predicted secondary structure that is consistent with the short-chain alpha-helical cytokine family and 82% conservation of residues associated with the Interleukin-4 family sequence motif. Comparisons of wallaby nucleotide and predicted peptide sequences with the coding domains of other vertebrate species demonstrate the diversity within this gene family; with nucleotide and amino acid identities of 74% and 59% with opossum, 52% and 32% with human and 38% and 19% with chicken homologues respectively. Despite these differences in sequence conservation, the putative Macropus eugenii Interleukin-4 mature peptide contains conserved structural motifs and predicted receptor-binding residues that suggest that it may retain functional properties associated with this important Th2 cytokine in other mammals.     

NDV长春株生物学特性及与国外毒株HN蛋白基因的同源性比较

以新城疫病毒（NDV）长春株接种9日龄SPF鸡胚增殖后,进行了蚀斑纯化（三代）鉴定,差数、蔗糖密度梯度离心提纯和生物学特性鉴定。结果表明,该病毒的鸡胚平均致死时间（MDT）大于168h,雏鸡脑内致死性（ICPI）为0.25,雏鸡静脉致死性（IVPI）为0,血凝解脱时间超过120h,血凝素热稳定性56℃ 5min 仍具有血凝活性。系统发育进化树分析表明,NDV长春株与La Sota株亲缘关系最近,为弱毒株。参考多株NDV HN基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR一次性扩增出NDV长春株的全长HN基因。将该HN基因插入pKS（-）后,进行了序列测定。序列分析表明,该HN基因苷酸长度为1731bp,编码577个氨基酸,序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基,与国外发表的NDV毒株序列相符,核苷酸同源性为88.1%～98.8%,推导的氨基酸同源性为91.1%～98.8%。     

西农萨能羊凝乳酶原前体cDNA的克隆与序列分析

参照GenBank登录的绵羊凝乳酶原前体cDNA序列设计引物,以新生5d的西农萨能羊皱胃组织总RNA为模版,通过RT-PCR方法获得凝乳酶原前体cDNA,克隆测序后进行序列比对。结果表明,克隆基因为B型凝乳酶,该基因cDNA具有1292个碱基,编码381个氨基酸,包含16个氨基酸的信号肽序列和42个氨基酸的酶原序列。将其与已报道的山羊、绵羊和牛的凝乳酶原前体序列进行比对,发现核苷酸同源性分别为99.41%、98.74%和95.29%,氨基酸同源性为99.21%、98.42%和93.70%。