猪瘟疫苗免疫保护临界值的研究

猪瘟(Hogcholera)是由猪瘟病毒引起的一种热性高度接触传染病,各个年龄阶段的猪群对该病均易感,目前仍然是危害我国养猪业的主要传染病之一。通过对北京市养猪场猪瘟流行病学调查,多数猪场仍存在多点散发现象,死亡率占总养猪量的4%～8%。为了确定猪瘟疫苗免疫抗体保护临界值,以便根据抗体监测结果实施免疫,本研究应用免疫动物攻毒实验进行了猪瘟疫苗免疫临界值的测定,为该病的科学免疫提供了依据。     

不同猪瘟疫苗对仔猪的免疫效果

选择24头断奶仔猪,随机分成4组,每组6头,其中1组猪瘟细胞苗(A苗)按5和10 mL的剂量进行注射,其他3组猪瘟脾淋苗(依次为B、C、D苗)均按1和2 mL的剂量进行注射。在免疫15 d后,分别采血、分离血清、按照猪瘟正向间接血凝试剂盒使用说明方法检测猪瘟抗体水平。检测结果显示,A苗、B苗、C苗、D苗检出的平均抗体水平与未注射之前的平均抗体水平之比分别为1∶51、1∶91、1∶114、1∶161。统计分析表明,猪瘟脾淋苗免疫效果最好,而猪瘟细胞苗和脾淋苗两者抗体水平差异不显著,但总体上使用4种疫苗免疫15 d后都能使仔猪获得良好的保护力。     

不同剂量猪瘟疫苗对免疫效果的影响

猪瘟是南猪瘟病毒（HCV）引起的高度传染性疾病,该病各种年龄猪均易发生,一年四季流行．严重威胁着养猪业发展。猪瘟最有效的控制方法是疫苗免疫．为研究猪瘟疫苗不同剂量对免疫效果的影响,本人在当地某猪场进行了免疫试验。本试验设计了4种不同的免疫剂量,其目的在于通过考察猪瘟疫苗的不同剂量对免疫效果的影响,以确定适宜的疫苗剂量,为科学制定猪瘟免疫程序,提供依据。     

猪瘟的免疫及疫苗

<正>猪瘟是当前我国猪场需要重点防控的传染病,随着养殖方式的变化和疫苗长期免疫的压力,猪瘟的发生也呈现新的变化,即主要表现为慢性温和型猪瘟和非典型猪瘟以     

猪瘟病毒E2基因DNA疫苗的试验研究

用构建的E2-pcDNA4.0 DNA疫苗对Balb/c小鼠、家兔和仔猪进行免疫,经3次肌肉接种,间隔15 d免疫后,测定抗体水平.结果表明,构建的DNA疫苗能诱导小鼠产生中和性抗体,免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(M ID)的猪瘟兔化弱毒苗的攻击.攻毒试验结果表明,E2-pcDNA4.0 DNA疫苗可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.     

香菇多糖对猪瘟疫苗免疫效果的影响

【目的】为了进一步提高猪瘟疫苗的免疫效果,探讨香菇多糖对猪瘟疫苗的免疫增强作用,为新型猪瘟疫苗免疫增强剂的研发提供理论依据。【方法】以不同剂量的香菇多糖作为猪瘟疫苗的稀释液免疫断奶仔猪,分别于免疫当天、免疫接种后第7、14、21、28d无菌操作采集血样,运用ELISA检测血清猪瘟抗体水平。【结果】香菇多糖可显著提高血清中的猪瘟抗体水平,第4组(0.1875mg香菇多糖)于免疫后14d和28d,猪瘟抗体阻断率平均值分别比猪瘟疫苗专用稀释液稀释组提高13.6%和12.2%;免疫合格率为100%。【结论】实验结果表明,将香菇多糖作为猪瘟疫苗稀释液稀释,可特异性提高猪体的免疫应答,香菇多糖具有显著增强猪瘟疫苗免疫效果的作用。     

县域范围内猪瘟疫苗免疫效果的监测与研究

以涟水县范围内的10家规模猪场开展了猪瘟疫苗免疫效果评价、免疫持续期检测及免疫增强剂应用效果研究,结果表明:(1)5个企业生产的猪瘟疫苗免疫效果均符合农业部规定的要求,但不同企业生产的猪瘟疫苗在免疫效力方面存在一定差异,疫苗二免后21 d抗体阳性率为77.5%¹00%,抗体离散度为19.7%100%,抗体离散度为19.7%⁴7.5%;其中一个企业的猪瘟疫苗免疫后4个月抗体阳性率仍达85%,离散度为38%,符合免疫要求;(2)添加免疫增强剂的疫苗二免后21 d、2个月、3个月、4个月时的抗体阳性率分别为90.8%、94.2%、92.5%、90.0%,比疫苗组分别高5.0、12.5、13.3、15.0个百分点;离散度分别为28.5%、27.9%、28.4%、28.0%,比疫苗组分别降低6.8、8.5、8.4、9.5个百分点;免疫增强剂的免疫促进作用明显。     

县域范围内猪瘟疫苗免疫效果的监测与研究

以涟水县范围内的10家规模猪场开展了猪瘟疫苗免疫效果评价、免疫持续期检测及免疫增强剂应用效果研究,结果表明:(1)5个企业生产的猪瘟疫苗免疫效果均符合农业部规定的要求,但不同企业生产的猪瘟疫苗在免疫效力方面存在一定差异,疫苗二免后21 d抗体阳性率为77.5%~100%,抗体离散度为19.7%~47.5%;其中一个企业的猪瘟疫苗免疫后4个月抗体阳性率仍达85%,离散度为38%,符合免疫要求;(2)添加免疫增强剂的疫苗二免后21 d、2个月、3个月、4个月时的抗体阳性率分别为90.8%、94.2%、92.5%、90.0%,比疫苗组分别高5.0、12.5、13.3、15.0个百分点;离散度分别为28.5%、27.9%、28.4%、28.0%,比疫苗组分别降低6.8、8.5、8.4、9.5个百分点;免疫增强剂的免疫促进作用明显。     

猪瘟免疫五要素

猪瘟俗称"烂肠瘟",其传染性强,危害程度高,是威胁养猪业的主要传染病之一,以猪瘟疫苗对猪进行免疫是控制猪瘟疾病发生的主要手段。从免疫程序、疫苗的质量、疫苗使用、使用药物和饲养管理等五个方面,就如何提高猪瘟免疫效果进行综述。     

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。     

GM-CSF与猪瘟病毒E2基因共表达载体的构建及其诱导的免疫应答

为探讨粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对猪瘟病毒E2基因核酸疫苗小鼠免疫应答诱导的影响,将CSFVE2基因和GM-CSF片段插入真核表达载体pcDNA3.0内构建pcE2,pcE2-GF及pcGF核酸疫苗.动物试验时,50只雌性供试小鼠随机分为5组,即pcE2,pcE2-GF,pcDNA3.0,pcGF,生理盐水组,每组10只.0,2,4周于小鼠左后肢胫前肌进行肌注免疫,质粒量为每只每次50μg.每次免疫前和末次免疫后2周尾静脉采血收集血清,ELISA检测血清内特异性IgG水平.末次免疫后1周每组随机选3只无菌取脾,MTT法检测淋巴细胞增殖情况.结果表明,与对照组比较,pcE2和pcE2-GF第3次免疫2周后,免疫小鼠IgG抗体水平逐渐增高,淋巴细胞的转化率也明显增高,且pcE2-GF免疫组的IgG抗体水平和淋巴细胞的转化率高于pcE2免疫组.可见,细胞因子GM-CSF可有效提高猪瘟病毒E2基因核酸疫苗的免疫应答.     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1．2×10^6PFU／mL、重组率为93．3％、85％插入片段处于750～2000bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23．3％ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75．9％ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogenn—activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll—like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（ESTcontig110和ESTcontig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

RT-PCR和免疫荧光抗体试验检测猪瘟病毒的比较研究

根据已发表的CSFV序列合成1对引物,以猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株为模板,建立并优化了检测CSFV的RT-PCR方法,并与直接荧光抗体试验(DFA)进行比较,检测了15份临床疑似病料。结果如下:应用RT-PCR对CSFV兔化弱毒株RNA进行扩增,获得与预期大小相符长为509 bp的特异性目的片段,敏感性达到10 pg的CSFV-RNA,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪2型圆环病毒(PCV2)进行同条件扩增均为阴性,RT-PCR产物测序结果与文献报道的CSFV不同毒株的核苷酸序列同源性达到95%~99%;15份临床疑似病料应用RT-PCR的检出率为66.7%,而应用免疫荧光试验的检出率为60.0%,二者的总符合率为80%。表明RT-PCR方法比DFA更敏感,两种方法均可用于猪瘟的快速诊断。     

整合猪瘟病毒囊膜蛋白的假型鼠白血病病毒感染性的研究

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪瘟病毒(CSFV)的E0、E2和E012基因并进行了克隆与鉴定。构建了真核表达载体pcDNA-E0、pcDNA-E2和pcDNA-E012,通过与鼠白血病病毒(MuLV)假型病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111瞬时共转染人胚肾细胞(293T),48h后收集假型病毒上清液,将假型病毒上清液超速离心后用抗CSFV的多抗进行Western-blot检测。结果证明E012蛋白能够在假型病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到此病毒粒子表面;用其感染多种宿主细胞,48h后检测发现在猪肾细胞(SK6,PK15)和猪睾丸细胞(ST)上,标记基因LacZ能有效表达,证实构建的CSFV假型病毒具有感染性。     

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒（CSFV）及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）,为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据GenBank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性（翠绿色）,其他非CSFV样本的检测结果均为阴性（桔红色）,且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。     

广西猪瘟病毒E2基因克隆及序列分析

[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近.     

猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法的建立和临床应用

根据猪瘟病毒5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和Taqman探针,建立Taqman实时定量RT-PCR检测猪瘟病毒法。检测结果显示,该方法的灵敏度为1μl 10拷贝,在病毒拷贝数为1μl 108～101时,循环数(Ct)值与拷贝数对数呈现较好的线性关系,且重复性好,批间变异系数小于1%。用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒,结果均为阴性。用该方法检测采集自江苏和新疆的192份组织和血清样品,猪瘟病毒阳性率为71.9%;检测感染猪的不同脏器,发现在心、肺、肝、肾、脑、脾脏、淋巴结、腹水中均可以检测到猪瘟病毒,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高。该方法的建立为猪瘟病毒的流行病学调查和定量提供了有效手段。     

猪瘟脾淋苗阻断多种基因亚群带毒母猪的垂直传播

为观察猪瘟脾淋苗限断多种基因亚群带毒母猪垂直传播的效果.选择5个有代表性的规模化猪场为试验点,分别将3种猪瘟带毒母猪(Subgroup1l,Suhgroup2.2,Subgroup2.3 )随机分成试验组和对照组.试验组采用猪瘟脾淋苗2头份免疫,对照组采用猪瘟细胞苗4头份免疫.采用酶联免疫吸附试验检测带毒母猪所产仔猪的猪瘟抗原状况.接受猪瘟脾淋苗免疫的带毒母猪Subgroup2.1,Subgroup2.2和Subgroup2.3所产仔猪的抗原阳性率分别为20.75%,18.75%,20.93%.明显低于对照组母猪所产仔猪的抗原阳性率(51.02%,44.83%,48.78%)猪瘟脾淋苗免疫多种基因亚群带毒,母猪对阻断垂直传播有很好的效果.