苏北部分地区南美白对虾养殖场白斑综合征病毒流行病学调查

采用nest - PCR方法对从扬州、泰州、南通三地的南美白对虾养殖场采集的1 300余份虾样、水生生物等样品进行白斑综合征病毒(WSSV)携带情况的调查.结果表明:516例对虾样品中139例为阳性,33份野生虾样品中7例为阳性,36例野生中华绒螯蟹样品中有2例阳性,317例浮游动物样品中检出阳性数为126例,229例浮游微藻样品中检出阳性数为16例,180例底泥样品中检测阳性数为34例,贝类、螺类及水样中未能检测到WSSV.调查结果提示,对虾、野生虾、浮游动物可能在南美白对虾感染WSSV过程中起着重要作用,中华绒鳌蟹及浮游微藻也有较低比例的携带病毒能力,其作用不可忽视.     

RNA干扰南美白对虾白斑病毒VP28基因的体外研究

为方便筛选VP28特异性siRNAs,通过构建真核表达载体pEGFP-VP28,然后将设计的siRNA与pEGFP-VP28共转染BHK细胞,并采用Western blotting检测GFP-VP28融合蛋白的表达情况以及半定量RT-PCR检验siRNA抑制VP28转录的效果,建立了体外RNA干扰法筛选系统。结果表明,pEGFP-VP28能在BHK细胞正常表达,设计的3对siRNA对VP28的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,其中siRNA2的干扰效果最为显著。研究结论为开展RNA干扰在对虾体内抑制WSSV的研究建立基础。     

南美白对虾白斑综合症防治技术探讨

对南美白对虾养殖危害最大、死亡率较高的是白斑综合症,在对其发病情况、症状、原因进行分析后,采取中西药结合的方法进行治疗,取得了较好的效果。     

宁波地区南美白对虾桃拉综合症病毒（TSV）的检测与分析

桃拉综合症病毒（Taura Syndrome Virus,TSV）是对虾养殖业危害较严重的病毒之一。应用RT—PCR技术,对2004～2008年在宁波地区收集的1201份南美白对虾样品进行TSV检测,旨在调查了解该地区TSV的流行情况,为科学防控该病的发生提供参考。结果表明,被检样品中,44份样品呈现阳性结果,总阳性率为3．66％,且2004～2008年南美自对虾TSV阳性检出率呈逐年降低的趋势。可见,宁波地区南美白对虾桃拉综合症已得到有效防制。     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶Nde I、Xho I酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a( )表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后,证实成功地构建了 VP28 基因原核表达载体pET-28a-VP28。转化菌经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 显示含有与预期大小一致的约30kDa蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95%的大肠杆菌重组蛋白VP28。该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量。实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45%。这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合症奠定了基础。     

VP28蛋白鸡源抗WSSV卵黄抗体的制备及性能分析

为了研制鸡源抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体（IgY）,利用WSSV毒株及其衣壳蛋白VP28制备成2种不同的疫苗,并分别免疫接种健康蛋鸡群,使鸡群产生不同的IgY,经病毒中和试验证实,2种IgY均有明显的抗WSSV效果,其中WSSV粗提液1∶1000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY对南美白对虾的保护率为61.7%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为48.3%;而WSSV粗提液1∶10000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为85.0%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为75.0%.     

南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测体系的建立

养殖对虾可混合感染多种病毒,桃拉病毒(Taura syndrome virus,TSV)和白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是南美白对虾感染的主要病原体,建立TSV和WSSV的多重聚合酶链式反应(PCR)技术可有效防制疫病的爆发。根据GenBank公布的TSV和WSSV全基因组序列,分别设计TSV和WSSV的特异性引物,并在四种不同的PCR系统中扩增筛选,在同一电泳道内得到与预期结果相符的、可明显区分的2条特异条带,PCR扩增产物测序显示分别与TSV和WSSV基因序列吻合,本体系的建立为生产鉴别和诊断混合感染病毒奠定基础。     

南美白对虾白斑病毒病的成因与防治

简要总结南美白对虾白斑病毒病的症状;对该病的成因进行分析,主要在于三个方面:一是虾体自身携带病毒、二是水环境污染、三是长期水质不化验;并提出具体的防治方法。     

LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螫虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大的病原之一,也是其他一些要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物.为了减少WSSV对克氏原螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检测法进行了比较.结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螫虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法.该结果也为其他虾类的WSSV检测提供了重要参考.     

白斑综合征病毒（WSSV）感染淡水枝角类的初步研究

采用WSSV发病对虾组织碎块投喂、WSSV粗提液投浸、WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌和酵母菌投喂对淡水枝角类进行白斑综合征病毒（WSSV）攻毒,然后将攻毒前后的淡水枝角类进行PCR检测。结果表明,投喂WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌可以感染淡水枝角类。     

白斑综合征病毒与凡纳滨对虾肠道菌群区系之间关系的初步研究

比较了同一养殖池中的感染白斑综合征病毒(WSSV)和未感染WSSV的凡纳滨对虾的肠道菌群,旨在探讨对虾肠道菌群与机体健康状态之间的关系。感染WSSV对虾肠道的细菌总数为1.06×106CFU/尾,显著高于未感染WSSV的对虾(1.78×105CFU/尾;P<0.05),且其肠道中的细菌分别属于弧菌属、气单胞菌属、海水球菌属、盐水球菌属和乳酸杆菌属;染WSSV的对虾(P<0.05),气单胞菌的比例显著的低于感染WSSV的对虾(P<0.05);盐球菌所占的比例两者之间差异不显著。结果显示,两种对虾在肠道菌群组成和细菌组成和细菌数量上存在显著的差异,初步表明对虾肠道菌群区系和机体的健康状态密切相关。     

白斑综合征病毒与凡纳滨对虾肠道菌群区系之间关系的初步研究

比较了同一养殖池中的感染白斑综合征病毒(WSSV)和未感染WSSV的凡纳滨对虾的肠道菌群,旨在探讨对虾肠道菌群与机体健康状态之间的关系。感染WSSV对虾肠道的细菌总数为1.06×106CFU/尾,显著高于未感染WSSV的对虾(1.78×105CFU/尾;P<0.05),且其肠道中的细菌分别属于弧菌属、气单胞菌属、海水球菌属、盐水球菌属和乳酸杆菌属;染WSSV的对虾(P<0.05),气单胞菌的比例显著的低于感染WSSV的对虾(P<0.05);盐球菌所占的比例两者之间差异不显著。结果显示,两种对虾在肠道菌群组成和细菌组成和细菌数量上存在显著的差异,初步表明对虾肠道菌群区系和机体的健康状态密切相关。     

不同温度下哈维氏弧菌和白斑综合症病毒对凡纳滨对虾的致病性

在不同温度[(19±1)、(25±1)、(31±1)℃]条件下,研究了不同浓度哈维氏弧菌Vibrio harveyi和白斑综合症病毒(WSSV)对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei(体长8.12 cm±0.83 cm)的致病性。结果表明:温度为(19±1)℃时,整个试验过程中对虾死亡率均低于8.9%,各组病毒携带量低于3.9×104copy/g;温度为(25±1)℃时,病毒单独感染组对虾的死亡率和病毒携带量(最大值71.1%,1.9×105copy/g)和高浓度继发感染组的死亡率和病毒携带量(最大值77.8%,3.2×106copy/g)从试验中期开始明显高于其他组,死亡加快,病毒携带量迅速增加,单独感染细菌组死亡率随感染浓度的升高而升高(最大值为21.1%);温度为(31±1)℃时,病毒单独感染组的死亡率和病毒携带量(最大值47.8%,2.2×104copy/g)从试验中期开始明显低于继发感染组(最大值80.0%,6.1×106copy/g),单独感染细菌组的累积死亡率随细菌浓度的升高而升高(最大值24.4%)。研究表明,温度对WSSV和哈维氏弧菌的致病力影响显著,继发感染和细菌单独感染随温度的升高致病力升高,高温和低温对WSSV的致病力有抑制作用。     

家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响

为研究饲料中添加家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响,在基础饲料中分别添加家蝇抗菌肽提取物0、1、2、3、4、5 g/kg,配制6种试验饲料.选取960尾健康、初始体均重为0.86(±0.01)g的凡纳滨对虾,分为6组,饲养8周后进行攻毒试验.结果显示,当抗菌肽提取物添加量为3 g/kg时,72 h内的累计死亡率与对照组相比显著降低.血细胞数量和吞噬率均以3 g/kg组最高,显著高于对照组、1、5g/kg组.当抗菌肽提取物添加量为2～3 g/kg时,对虾血清过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)活性和总抗氧化能力(T-AOC)均维持在一个较高的水平,且显著高于对照组;4 g/kg组超氧化物歧化酶(SOD)活性与对照组相比显著升高,肝胰腺AKP活性、T-AOC水平均以4 g/kg组最高,显著高于对照组;3g/kg组LZM活性显著高于对照组、1、4、5 g/kg组.结果表明,饲料中添加适量的家蝇抗菌肽可以提高凡纳滨对虾的免疫力和抗白斑综合征病毒的能力.     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白.将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、Xho Ⅰ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a(+)表达载体上.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体pET-28a-VP28.转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达.采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95％的大肠杆菌重组蛋白VP28.该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量.实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14 μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45％.这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合征奠定了基础.     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31与该病毒侵染的相关性

白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体.根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp.通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFAST BAC HTB上.重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带.用Ni2 柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验.中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能起着重要作用.     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31与该病毒侵染的相关性

白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体.根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp.通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFAST BAC HTB上.重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带.用Ni2 柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验.中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能起着重要作用.     

不同靶点shRNA干扰对虾白斑综合征病毒增殖效果分析

设计合成了靶向对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组不同佗点的5个shRNA:RR9、RR1、DP1、DP2和PK1,并在凡纳滨对虾体内实施了RNA干扰(RNAi)抗WSSV增殖的试验.结果显示:5个shRNA不同程度地抑制了WSSV的复制,降低了对虾的死亡率,其中,靶向病毒核糖核酸还原酶的shRNA RR9的RNA干扰效果最佳.     

白斑综合征病毒广西株缺失区基因的比较分析

为了解广西养殖凡纳滨对虾中白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的感染流行情况,并探讨WSSV广西株缺失区ORF23/24基因的遗传进化差异及其与各地WSSV毒株间的遗传进化关系,2010年5月至2013年9月在广西凡纳滨对虾主产区北海、钦州和防城港共采集306份患病虾样品,应用世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式聚合酶链式反应(nested-PCR)方法进行WSSV检测;选取第一轮PCR为阳性的53份样品进行缺失区ORF23/24基因的PCR扩增,并将12份阳性PCR产物进行克隆、序列测定与比较分析。结果显示:306份患病虾样品中有82份为WSSV感染阳性,阳性率为26.8%;12株WSSV广西株缺失区ORF23/24基因大小均为2 096 bp,相对于此区域最为完整的WSSV-TW株,广西株均在中间缺失了10 970 bp;12株WSSV广西株的缺失区ORF23/24基因差异小,核苷酸同源性均在99.6%以上,仅存在少数碱基的替换,没有缺失和插入,其中BH-3、QZ-1、FCG-1和FCG-2的核苷酸序列完全一致;基于缺失区构建的系统发育进化树显示,WSSV广西地方株在遗传上相距较近,全部与印度株IN-05-Ⅰ聚在一个大的分支,而与台湾株、中国株及韩国株在遗传上相距较远。研究表明,WSSV感染在广西凡纳滨对虾主要养殖地区存在一定程度的流行;广西WSSV毒株缺失区ORF23/24基因的变异类型为中间大片段缺失,各毒株间无明显的地域和时间差异;WSSV广西株与印度株IN-05-Ⅰ的遗传进化关系最近。     

黄芪多糖对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的效果研究

研究了基础饲料中添加不同浓度的黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的效果。用添加0%、0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖的基础饲料作为药饵,投喂20 d后,对各组经PCR检测WSSV呈阴性的健康克氏原螯虾进行WSSV病毒悬液腹节背部注射攻毒试验,当添加0%黄芪多糖的阳性对照组中死亡率达到100%时,添加0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖实验组的死亡率分别为(86.67±13.33)%、(91.11±7.70)%、(73.33±17.64)%。为了评价黄芪多糖对克氏原螯虾各器官组织的影响,对其鳃、肝胰腺、心肌组织进行病理组织切片观察,结果发现:添加0%黄芪多糖的阳性对照组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺、心肌组织出现细胞排列无序、细胞破裂、核仁皱缩等明显的病理变化;而添加0.8%黄芪多糖的实验组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,心肌组织核仁出现一定程度的皱缩,但细胞尚未破裂。研究表明:与阳性对照组相比,添加0.8%的黄芪多糖可提高26.67%的存活率,对克氏原螯虾抗WSSV感染有很好的提高效果,可望在生产中收到良好的经济效益。