检测山羊嵴病毒的实时荧光定量PCR方法的建立和应用

山羊嵴病毒(caprine kobuvirus,CKoV)是国内山羊新发病毒,本试验目的是建立检测CKoV的实时荧光定量PCR方法,并对西南三省腹泻山羊粪样进行该病毒的检测.选择CKoV最保守的3D基因序列,设计3D基因引物,初步设计实时荧光定量PCR,经优化反应条件和反应体系,成功建立了检测CKoV的TB Green...     

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法.结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量P...     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了研究检测非洲猪瘟病毒的方法,试验采用GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列设计了1对特异性引物和探针,并使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法.结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性.     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列,设计了一对特异性引物和探针,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法。结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性。     

荧光定量PCR检测Meq基因在马立克氏病病毒感染过程中的动力学变化

为探讨马立克氏病病毒强、弱毒株致癌基因Meq在感染过程中的变化规律,本研究用超强毒株RB1B与疫苗株CV1988分别感染次代鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fiber cell,CEF）,用荧光定量PCR方法检测Meq的变化规律。结果发现,疫苗株CV1988的Meq在感染细胞内持续上调,而超强毒株RB1B的Meq在感染细胞内72h前为逐渐上调,然后下调;动物感染试验结果发现,超强毒株RB1B的Meq在鸡胸腺和脾脏组织内均表现为感染d21出现一个表达高峰,而疫苗株CV1988的Meq在SPF鸡胸腺q-d14出现高峰,然后下降。有趣的是CV1988的Meq在脾脏组织中d14表达最低,然后持续升高。本研究为进一步研究Meq在马立克氏病病毒感染过程中的致瘤机理提供重要资料。     

爱滋病毒抗原（P24）检测马传染性贫血性病毒的研究

本研究通过基因工程技术生产了受滋病毒的Ｐ２４抗原,并且运用于马传贫病毒的血清学检查,与传统方法所制备的马传贫抗原对照检测军马２５２４匹以及本实验室保留的各种马传贫阳性血清２２４份。结果显示马传贫血清能够免疫沉淀爱滋病毒（ＨＩＶ）的Ｐ２４,表明它们之间有着共同的抗原决定簇,且Ｐ２４检测法检测率高,检测周期仅３￣４ｈ,明显优于传统法,可用于马传贫的快速检测。     

鹦鹉源禽博尔纳病毒的鉴定及全基因序列分析

为了对疑似禽博尔纳病毒感染病例进行确诊,并了解鹦鹉源禽博尔纳病毒毒株的流行特点,本试验设计合成1对特异性引物,对疑似感染禽博尔纳病毒而死亡的鹦鹉进行检测,并设计7对首尾重叠的引物对其中1株确诊的博尔纳病毒全基因进行RT-PCR扩增、测序,应用DNAStar和MEGA6.06软件将本次获得的PaBV-4与GenBank上...     

马立克氏病病毒CV1988株pp24基因的克隆与表达

根据马立克氏病病毒（MDV）国际参考强毒CA株pp24基因序列，设计和合成了一对引物，其两端分别含SalI和EcoRI的酶切位点，以CV1988株基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增其pp24基因。PCR产物经纯化后，按正确的阅读框架定向克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，并用序列测定验证。将重组质粒转化的大肠杆菌BL21，在1.0mMIPTG和37℃条件下诱导，GST-pp24基因获得了表达。诱导菌体的裂解物经12%的SDS聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）和Westemblot试验验证。得到大小为43kD的融合蛋白，与预期大小一致。将该融合蛋白的凝胶带切下研碎后免疫小鼠三次后，其血清与MDV感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在间接免疫荧光试验中呈阳性反应。     

基于E184L基因的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高度接触性传染病。由于ASFV的感染机制极为复杂,基因型多,至今尚无有效疫苗用于防控,防止该病暴发主要依赖于早期快速诊断和控制。为建立一种高效快速、特异的ASFV检测方法,根据ASFV的E184L基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,建立了检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法设计的引物具有高度特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数为0.992,对ASFV核酸最低检测限为1.51拷贝,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等不存在交叉反应。建立的基于ASFV E184L基因实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异地对ASFV核酸进行定量分析,丰富了ASFV的检测方法。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟病毒p54蛋白在病毒感染与增殖过程中起重要作用.根据p54基因的核苷酸序列,设计并合成引物和用6-carboxy-fluorescein (6-FAM) 和tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) 荧光素标记Taq Man双水解探针,以构建的含p54基因的pET-p54重组质粒作为阳性模板,建立了ASFV检测的荧光定量PCR方法(已申请专利,专利号200910067620.6).结果表明,所建立的方法与含p54基因的模板质粒数呈现很好的相关性(R2=0.991),可检测出低于15个拷贝/μL的样品,灵敏度和特异性高,可作为出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测方法.     

High prevalence of Borna disease virus in domestic cats with neurological disorders in Japan

A total of 15 (T-1–T-15) domestic cats with neurological disorders in Tokyo area were examined for association with Borna disease virus (BDV). None had detectable antibodies to feline immunodeficiency virus (FIV), feline leukemia virus, feline infectious peritonitis virus and Toxoplasma gondii, and only cat T-8 had detectable antibody to FIV. Serological and molecular epidemiological studies revealed a significantly high prevalence of BDV infection in these cats: antibodies against BDV p24 and/or p40 proteins in 10/15 (66.7%) and p24 and/or p40 RNA in peripheral blood mononuclear cells in 8/15 (53.3%). Further, in situ hybridization and immunohistochemistry analyses of the autopsied brain samples derived from one of the cats (T-15) revealed BDV RNA predominantly in neuronal cells in restricted regions, such as olfactory bulb and medulla of cerebrum. Thus, BDV is present in Japanese domestic cats with neurological disorders at a high prevalence.     

Seroprevalence of Borna disease virus in domestic animals in Xinjiang, China

To investigate the animals infected with Borna disease virus (BDV) in Xinjiang, China, we examined for BDV antibodies in the sera from groups of 20 horses, sheep and cattle, and from 165 wild rodents (18 species) by ELISA and immunoblot. The serological study disclosed the presence of antibodies to both BDV-p24 and -p40 in the horses (20%) and sheep (25%), whereas no apparent positive reaction was detected either in cattle or rodents. The results suggested that BDV is prevalent in horses and sheep in the district investigated.     

检测伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR方法的建立

利用DNAMAN软件对GenBank登录的伪狂犬病病毒（PRV）各毒株gB基因序列进行比对分析,选择其保守区域设计合成特异性的引物和TaqMan探针,同时利用普通PCR技术扩增获得全长的伪狂犬病毒gB基因,并克隆到pMD20-T载体上作为阳性标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种快速检测伪狂犬病病毒的荧光定量PCR技术。该检测技术具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。对制备的pMD-gB阳性标准品的检测结果表明,所建立的伪狂犬病毒TaqMan荧光定量PCR最低检测极限可达1.50×102拷贝/反应;同时相比于普通PCR方法其灵敏度高100～1 000倍以上,并且重复性好。在对60份临床样品的检测中,荧光定量PCR不仅检出了普通PCR检测为阳性的样品,且检出了2份普通PCR未检出的样品,进一步证实了该方法快速、灵敏性好,可用于PRV感染的早期快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

IGF-1和IGF-1R基因在辽宁绒山羊皮肤组织中的表达

为了研究类胰岛素生长因子1(IGF-1)和类胰岛素生长因子1受体(IGF-1R)基因在绒山羊绒毛生长不同阶段皮肤组织中的表达差异,试验采用实时荧光定量PCR技术对非产绒期和产绒期辽宁绒山羊皮肤中IGF-1和IGF-1R基因的表达进行了测定。结果表明:辽宁绒山羊皮肤中IGF-1和IGF-1R mRNA的表达量在产绒期均极显著高于非产绒期(P<0.01),产绒期IGF-1、IGF-1RmRNA的表达水平分别是非产绒期的8.30倍和7.49倍。说明IGF-1和IGF-1R基因可能与山羊绒周期性生长有关。     

传染性法氏囊病病毒感染细胞内源性microRNA表达差异分析

细胞内源性microRNA（miRNA）在宿主与病原相互作用过程中发挥着重要的调节功能。为了分析细胞内源性miRNA与传染性法氏囊病病毒（IBDV）的相互作用,用IBDV弱毒和强毒分别感染鸡胚成纤维细胞（CEF）和SPF鸡,24h后,取感染CEF和法氏囊组织,提取细胞总RNA,用Hy3/Hy5双色荧光标记,与miRNA芯片杂交,进行芯片内标准化、芯片间标准化、表达差异比较以及聚类分析。结果显示：在IBDV弱毒感染的CEF中,有17个细胞内源性miRNA表达上调,17个miRNA表达下调;在IBDV强毒感染的鸡法氏囊组织细胞中,有30个细胞内源性miRNA表达上调,18个miRNA表达下调。根据表达差异显著的miRNA序列设计引物,用荧光定量RT-PCR方法验证芯片检测结果,2种方法的检测结果一致。结果表明,IBDV感染可诱导细胞内源性miRNA表达变化,这些上调或下调的miRNA能调控细胞内多种代谢和信号传导途径发生异常,引起细胞及组织器官发生病理学变化。     

脂多糖对奶山羊肝脏脂代谢关键基因表达的影响

12只初产萨能奶山羊被随机分为对照组和脂多糖(LPS)组,每组6只.试验结束后,采集肝脏组织,利用荧光定量PCR的方法检测肝脏TLR4信号通路关键分子、脂肪合成和转运关键基因的表达.结果显示,LPS能上调TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB基因的表达,下调LXRα、CD36、VLDLR、APOB、ACC和SCD的表达,对LXRβ和PPAR的表达影响不大.结果表明,LPS诱导肝损伤的同时能下调肝脏脂代谢基因的表达,进而降低肝脏合成与转运脂肪的能力.     

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测.结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别.     

Quantitative real-time PCR assays for the concurrent diagnosis of infectious laryngotracheitis virus,Newcastle disease virus and avian metapneumovirus in poultry

Newcastle disease (ND), infectious laryngotracheitis (ILT) and avian metapneumovirus (aMPV) can be similar making it critical to quickly differentiate them. Herein, we adapted pre-existing molecular-based diagnostic assays for NDV and ILTV, and developed new assays for aMPV A and B, for use under synchronized thermocycling conditions. All assays performed equivalently with linearity over a 5 log₁₀ dynamic range, a reproducible (R² > 0.99) limit of detection of ≥ 10 target copies, and amplification efficiencies between 86.8%–98.2%. Using biological specimens for NDV and ILTV showed 100% specificity. Identical amplification conditions will simplify procedures for detection in diagnostic laboratories.