杜大长猪IGF-I基因的克隆及其序列分析

采用ＴＲＩzol法从杜大长杂交猪的肝脏中提出总ＲＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板 ,以设计的Ｐ１（５′－ＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣ－３′）为引物合成ＩＧＦ－Ｉ基因cＤＮＡ的第１链,再以Ｐ１和Ｐ２（５′－ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴ－３′）为引物扩增到大小约为３６０bp的产和,并将其达隆至pＧＥＭ－Ｔ载体上。经筛选、酶切、我分析,表明该片段为ＩＧＦ－Ｉ基因的cＤＮＡ     

PCR扩增猪ESR基因一个外显子DNA片段的研究

根据文献资料，参考人，鸡，鼠等动物的ＤＮＡ序列，结合本研究的需要，我们设计了一对引物，其上游正向引物中Ｐ１为５′－ＧＡＴＡＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧ－３′（对应于鼠ＥＳＲ基因第４外显子１０１０－１０２９）下游反向引物Ｐ２为５′－ＧＣＡＣＴＣＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＧ－３′（对应于鼠ＥＳＲ的基因第４外显子１３２２－１３４１）利用该引物对，按照首轮反应９４℃５分钟，５８℃１分钟，７２℃１分钟，     

伊氏锥虫微环DNA的PCR扩增

伊氏锥虫是动物伊氏锥虫的病原体，属动基体目原虫，动基体ＤＮＡ（ＫｉｎｅｔｏｐｌａｓｔＤＮＡ简称ｋＤＮＡ）是该目原虫所特有的一种非染色体ＤＮＡ。因此，对ｋＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增可用于鉴定和检测伊氏锥虫。本文以５－ＣＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴ－３’，５’－ＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＡＴＧＧＴ－３’为引物，对从伊氏锥虫直接抽提的总ＤＮＡ，ｋＤＮＡ以及ｋＤＮＡ基因重组子，经ＰＣＲ扩增后，在含有０．５μ     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD—PCR扩增产物及它们基因 …

Ｋ７００ｂｐ是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－３’），通过ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增出来的一个特有ＤＮＡ片段。然后将Ｋ７００ｂｐ制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ片段。     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD-PCR扩增产物及它们基因组DNA分子杂交的研究

Ｋ７００ｂｐ 是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－ ３’） ，通过ＲＡＰＤ－ ＰＣＲ 扩增出来的一个特有ＤＮＡ 片段。然后将Ｋ７００ｂｐ 制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ 确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ 片段。     

4型菌毛、毒素及蛋白酶在动物源气单胞菌的检测

将来源于鱼、猪、犬等９种动物的１８株气单胞菌分离株通过ＡＤ（氨苄青霉素－糊精）培养基纯化。另以大肠杆菌束状菌毛相关（ｂｆｐ－ｒｅｌａｔｅｄ）基因的ＰＣＲ引物对ＥＢ１（ＧＡＴＴＧＡＡＴＣＴＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣ）—ＥＢ２（ＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡＣＡＴＡＴ）扩增,用ｄｉｇｏｘｉｎｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ标记,构建核酸探针,作斑点杂交试验,用以检测上述气单胞菌菌株的４型菌毛,同时以溶血试验检测其毒素,用脱脂奶溶蛋白圈试验检测其蛋白酶。结果显示,在１８个菌株中,４型菌毛、毒素和蛋白酶均为阳性者为１０株（５５．６％）;３项指标均无肯定的阳性结果者４株,两者合计共１４株,占检测总数约８０％（１４／１８）,提示这３种毒力因子存在较高的相关性。所有鱼源株（５株）三项指标皆为阳性;４株猪分离株三项指标均为阳性者占一半;其它动物分离株检测结果无明显规律性     

基因探针和PCR对鲤吉陶单极虫的检测

采用液氮冷冻研磨法破碎吉陶单极虫（Ｔｈｅｌｏｈａｎｅｌｕｓｋｉｔａｕｅｉ）孢子，按常规法提取其基因组ＤＮＡ。取ＤＮＡＥｃｏＲＩ消化产物，采用低熔点琼脂糖回收法制备大（３．０～１５．０ｋｂ）、小（０．５～３．０ｋｂ）片段，将其克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｋｓＥｃｏＲＩ位点，经α－互补现象、酶切鉴定和虫体ＤＮＡ生物素标记探针筛选，构建了含２３个克隆的基因文库，克隆片段介于０．９～６．８ｋｂ之间；经阳性克隆标记筛选及特性分析，制备了长度为０．９ｋｂ（１９号质粒克隆片段）的探针，该探针具有较强的敏感性和特异性。对该探针两端ＤＮＡ序列进行分析，设计出１对引物。上游引物序列为：５′ＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＣＡＡＧ３′，下游引物序列为：５′ＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧ－ＴＡＴＣＧＣＴＧＣ３′。应用该对引物对虫体进行了检测     

RT-PCR法分离伊氏锥虫VSG基因的研究

应用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法分离伊锥虫安微株克隆虫体ＳｈＴａｔｌ的二信抗原变异体ＳｈＴａｔ１．３和ＳｈＴａｔ１．５总ＲＮＡ，在含有甲醛物琼脂糖凝胶电泳后，转印到硝酸纤维膜上。根据布氏锥虫ＶＳＧｍＲＮＡ３’端保守序列，设计合成了一个互补于它的含十八个碱基的寡核苷酸５’－－ＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧ－３’，经＾３２Ｐ标记，Ｎｏｔｒｈｅｒｎ杂交，首次证明２伊氏锥虫含有同样的保守序列。利用合成的十     

牛生长激素基因第五外显子Msp I多态性在几个牛种中的差异

牛生长激素基因位于第 1 9号染色体上 ,含有大约 1 793个核苷酸 ,由 5个外显子及 4个内含子序列组成。为了研究生长激素基因位点在不同牛品种中的多态性差异 ,根据ＧｅｎｅＢａｎｋ的登记号为Ｍ 5 776 4的牛生长激素基因序列 ,设计了一对引物 ,上游引物 :5’ＧＧＧＣＡＧＡＴＣ ＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡ 3’ ;下游引物 :5’ＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣ 3’。扩增片段从 2 1 6 5位至2 5 0 4位。产物长度为 34 0ｂｐ ,含第五外显子区。以西门塔尔牛 ( 1 2 6头 ) ,鲁西黄牛 ( 1 4头 ) ,纯种皮埃蒙特牛 ( 8头 ) ,皮埃蒙特×南阳杂种牛 …     

鹅源腺病毒Y81G4株基因组末端倒置重复序列（ITR）的核酸鉴定 …

对鹅源腺病毒株Ｙ８１Ｇ４基因组两则末端序列测定和比较，鉴定其其ＩＴＲ区。Ｙ８１Ｇ４株ＩＴＲ全长为１２５ｂｐ，远长于其它禽１、２、３群腺病毒ＩＴＲ长度。在Ｙ１８Ｇ４株ＩＴＲ中有一些腺病毒ＩＴＲ序列特征：（１）Ｓ’－Ｃ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＮＴＣＡＴ－现毒典型起始序列；（２）９～１３ｂｐ存在腺病毒科共的（Ａ／Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｔ）ＡＴＡ保守序列；（３）在ＩＴＲ区３７～４２ｂｐ出现的ＧＮＧＧＣＧ保守序列；（４）     

鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gC和gD基因的克隆及序列分析

根据已发表的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＳＡ－２株的核酸序列,设计了１对引物,以ＩＬＴＶ－中国王岗株ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ法扩增出１条１．３９ｋｂ的基因片段,将扩增产物插入到真核表达质粒ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＤ,另将克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质料中的ｇＣ基因酶毁后,插入到ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ载体,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＣ,经电泳分析、酶分、ＰＣＲ鉴定后,进行序列测     

鸡T淋巴细胞IL－2的体外诱生及活性检测

经Ｌ１６（４５）正交试验选择，并经实验验证，鸡脾脏Ｔ淋巴细胞白细胞介素２（ＩＬ－２）体外诱生和活性检测的最优水平组合及适宜条件为２．５μｇ／ｍＬ伴刀豆蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）、ＩＬ－２体外诱生时间２０ｈ、１×１０７／ｍＬ淋巴细胞、１０％小牛血清、靶细胞培养时间４８ｈ、４×１０６／ｍＬ靶细胞、靶细胞接触时间３６ｈ、５ｍｇ／ｍＬＭＴＴ、ＭＴＴ加入时间３ｈ和甲溶解时间２ｈ；胸腺Ｔ淋巴细胞ＩＬ－２体外诱生和活性检测的最优水平组合及适宜条件为５μｇ／ｍＬＣｏｎＡ、ＩＬ－２体外诱生时间４８ｈ，余同脾脏Ｔ淋巴细胞ＩＬ－２体外诱生及活性检测。比较试验表明，ＭＴＴ比色分析法和３Ｈ－胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）掺入法有显著的直线回归关系。     

牦牛,黑白花牛及其远缘杂种RAPD标记的初步研究

本文用８０个具有１０个碱基的随机引物对牦牛、黑白花牛及犏牛的基因组ＤＮＡ进行了ＰＣＲ扩增。结果表明有７个引物扩增出清晰且具多态特征的条带,其中,Ｆ１５（ＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣ,５６４－１２５ｂｐ）可作为区分牦牛与黑白花牛的重要 的。 试品种相似性指数分析表黑白花牛与犏牛的遗传距离最小（０．５９４２）;黑白花与牦牛的遗传距离最大（０．６４５６）;而犏牛与牦牛的遗传距离居中（０．６４１０）。群体遗传多样     

鸡痘病毒282E4株2.2kbTK基因序列分析

将鸡痘病毒２８２Ｅ４弱毒株基因组中的３．７ｋｂＨｉｎｄⅢ片段克隆到ＫＳ（－）质粒中，亚克隆后，获得含ＴＫ基因正反方向插入的２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ－ＣｌａＩ片段的质粒ｐＫＦＡ和ｐＫＦＢ，进而构建出正反方向的系列嵌套缺失质粒。用Ｔ７、Ｔ３引物所做的核苷酸序列分析表明，２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ－ＣｌａＩ ＴＫ基因序列长为２１５９ｂｐ，含有两个完整的读码框架（ＯＲＥ）Ｘ和ＴＫ，并确证了ＴＫ基因内存在单一酶切点Ｎ     

反相HPLC测定猪血浆中隐丹参酮及其活性代谢物的血药浓度

本试验建立了用反相ＨＰＬＣ同时进行猪血浆中隐丹参酮（ＣＴ）及其活性代谢物丹参酮ⅡＡ（Ｔｓ－ⅡＡ）的快速定量检测方法。采用ＹＷＧＣ１８键合相柱作为分析柱，甲醇－水（８５１５）为流动相，检测波长２５４ｎｍ，二苄基为内标。平均回收率分别为ＣＴ：８８．０９％，Ｔｓ－ⅡＡ：８８．５１％；原药及代谢物的检测限为１０ｎｇ，血浆中最低检出浓度为１６ｎｇ／ｍｌ。日内、日间的变异系数为１．５４％～６．２８％，血浆浓度０．０４～２．５μｇ／ｍｌ范围内呈线性关系，ｒ＝０．９９１４（ＣＴ）及０．９９８８（Ｔｓ－ⅡＡ）。用此法对５头猪进行了ｉｖＣＴ后的ＣＴ及Ｔｓ－ⅡＡ的血浆浓度测定，得出了药时曲线数据。     

传染性法氏囊病病毒VP2/VP0基因在重组鸡痘病毒中的表达

以鸡痘病毒复制非必需区ＴＫ基因为侧翼,在牛痘病毒Ａ型包涵体晚期启动子（ＡＴＩ）与１６个串联的突变型早期痘苗病毒ｐ７．５启动子组成的复合启动子的下游,分别插入编码传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）结构蛋白ＶＰ２和ＶＰ２－４－３（ＶＰ０）的基因片段后,进行了同源重组和蓝斑筛选,获得２株重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７和ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０。经ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７能表达ＶＰ２,ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０能表达ＶＰ２和ＶＰ３,ＶＰ２和ＶＰ３的Ｍｒ分别为４１０００和３２０００。     

SV40增强子在bGH转基因鼠体内对真核基因转录效率的影响

把ＳＶ４０的增强子序列以紧邻（ｐＳＶＣＡＴＬＢＧＨ）和相距２．３ｋｂ的距离克隆到小鼠金属巯基组氨酸三甲内盐基因（ＭＴ－Ｉ）启动子的上游，用以研究了在体内（ｉｎｖｉｖｏ）环境下原核基因的增强于对真核基因转录调控的影响，以及增强子与启动子的距离对增强于增强转录效率的影响。在建立了ｐＳＶＣＡＴＬＢＧＨ和ｐＳＶ２ＬＢＧＨ两种转基因结构的不同种系的转基因鼠后，通过分析ＩＣＲ、ＫＢ（昆明白）和Ｃ５７ＢＬ３种种系的ｐＳＶＣＡＴＬＢＧＨ转基因鼠的６种主要器官中的ＣＡＴ活性，证明ＳＶ４０增强子可以增强真核基因──ＣＡＴ基因的转录效率而无种属及组织特异性；通过比较ＩＣＲ和昆明白（ＫＢ）两种种系的ｐＳＶＣＡＴＬＢＧＨ和ｐＳＶ２ＬＢＧＨ转基因鼠的心脏和肝脏中ｂＧＨｍＲＮＡ水平，证明在转基因鼠体内，在２．３ｋｂ距离内，ＳＶ４０增强子对由ＭＴ－Ｉ启动子启动的真核基因──ｂＧＨ基因的转录效率的增强效果无明显差异。     

香猪后备猪体内酶水平和无机盐含量的测定与分析

对８头公头猪和５头母猪分别进行血清ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、Ｃｈｅ，ｒ－ＧＴ及血清Ｃａ，Ｐ，Ｎａ，Ｋ和Ｃｌ含量的测定与分析，结果表明公猪和母猪除胆碱酯酶外，其他指标在性别上无明显差别。     

重组人白细胞介素6表达载体的构建及共在大肠杆菌中的高效表达

本研究合成了两个成熟人ＩＬ－６ｃＤＮＡ引物，采用ＰＣＲ法扩增出了成熟人ＩＬ－６基因片段，并在其５＇端加入了一个ＥｃｏＲＩ部位和ＡＴＧ，３＇端加入了一个ＢａｍＨＩ部位和ＴＡＡ。利用ｐＢＶ２２０质粒构建成功了ｐＢＶ２２０ＩＬ－６表达载体。将重组质粒导入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ中，经３０℃扩增的４２℃诱导，表达出了分子量为２１０００的预期蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析与溥层证明具有明显的ＩＬ－６活性。实验还对     

鸡传染性法氏囊病病毒野毒株VP2基因高可变区酶切位点分析

参照澳大利亚鸡传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ）００２７３ 毒株基因组序列设计的 １ 对引物,位于 Ｖ Ｐ２ 高可变区两端,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ,扩增了 ５ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 山东分离株 Ｖ Ｐ２ 基因的 ６０７～１ ０８０ 位核苷酸片段（ａａ２０３～３０６）。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经纯化后,分别用 Ｄｒａ Ⅰ、 Ｓａｃ Ⅰ、 Ｓｓｐ Ⅰ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓａｕ３ Ａ Ｉ共 ５ 种限制性内切酶（ Ｒ Ｅ）进行消化处理,结果 ５ 个分离株均为 Ｄｒａ Ⅰ（－ ）、 Ｓａｃ Ⅰ（－ ）和 Ｓａｕ ３ Ａ Ｉ（＋ ）, Ｌ Ｃ２ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（＋ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｊ Ｎ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（－ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｌ Ｃ２ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（＋ ）, Ｊ Ｎ、 Ｌ Ｌ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（－ ）;５ 个分离株的酶切图谱与美国变异株迥异,而 Ｔ Ａ 株与日本超强毒株 ９０１１ 相类似。５ 个分离株与现用疫苗株对比,至少在 Ｖ Ｐ２ 可变区内存在着一定的差异,这可能是 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 接种免疫鸡群仍然暴发 Ｉ Ｂ Ｄ 的原因之一。