内质网应激与病毒感染(综述)

内质网在细胞内负责蛋白质和脂类合成、加工及成熟。当病毒感染细胞时,也同样会利用内质网完成病毒本身蛋白质合成。同时,大量病毒蛋白堆积,会诱发内质网的应激反应,随后内质网调控各种信号通路维持细胞稳态与生命体的整体利益,进而引起细胞自噬及凋亡、代谢综合征。有些病毒会通过改变对自身复制不利应激通路的蛋白表达,同时,维持对自身有益的方面来加强病毒本身的复制。本文对内质网应激和未折叠蛋白反应信号通路及对一些病毒感染与内质网应激的相互作用和一些病毒感染导致的代谢综合征进行简要综述,总结了关于内质网应激与病毒感染的最新研究成果,旨在为内质网应激有关的抗病毒感染研究提供思路。     

疱疹病毒引起内质网应激/未折叠蛋白反应研究进展

内质网是真核细胞内蛋白质折叠及翻译后修饰的主要场所，还参与调控Ca2+和脂类物质储存合成，具有重要生理功能。疱疹病毒是一类具有囊膜的DNA病毒，其表面糖基化囊膜蛋白的合成加工依赖于内质网，在病毒复制过程中，大量合成的糖基化囊膜蛋白在内质网内过度堆积则会引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS），进而发生未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。某些疱疹病毒可能已经进化出调控UPR的机制，为复制过程创造最佳环境，它们在宿主细胞内复制时，会引起相关内质网UPR信号级联反应，如细胞损伤、炎症反应、细胞凋亡等。综述了内质网应激/未折叠蛋白（ERS/UPR）对病毒的反应机制，从Ⅰ型单纯疱疹病毒、伪狂犬病病毒、马立克病病毒、鸭肠炎病毒和其他疱疹病毒等感染引起ERS分子机制及相关信号通路进行阐述，以期为疱疹病毒相关疫苗和药物作用靶点的研发提供理论依据。     

内质网应激与胰岛素抵抗的研究进展

未折叠或错误折叠蛋白质在内质网腔蓄积及细胞内稳态的破坏将导致内质网应激。适宜的应激有利于细胞内环境的恢复,然而严重而持久的内质网应激反应将导致内质网功能受损,诱导细胞凋亡。内质网应激介导的β细胞凋亡促进胰岛素抵抗的发生,减轻内质网应激可改善胰岛素抵抗和糖尿病的相关表现。     

蛋白质的品质管理

概述了蛋白质品质管理中涉及的分子伴侣、激发未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)和内质网相关性蛋白质降解途径(ER-associated degradation,ERAD)等的研究进展,并探讨了该领域存在的问题以及发展前景。指出蛋白质的生命过程经历生成、折叠、组装和降解,每个过程都有严格控制。内质网中,各种蛋白质合成、折叠并经修饰形成具有一定构象的功能性蛋白。其在内质网折叠受阻碍时,未折叠的蛋白聚集,激发UPR,使一系列分子伴侣和蛋白质折叠所需修饰酶类表达上调,帮助其完成折叠和装配。如果这些蛋白仍不能正确折叠,则进入ERAD被降解。     

蛋白质分子的一生——蛋白质的品质管理(英文)

概述了蛋白质品质管理中涉及的分子伴侣、激发未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)和内质网相关性蛋白质降解途径(ER-associated degradation, ERAD)等的研究进展,并探讨了该领域存在的问题以及发展前景。指出蛋白质的生命过程经历生成、折叠、组装和降解,每个过程都有严格控制。内质网中,各种蛋白质合成、折叠并经修饰形成具有一定构象的功能性蛋白。其在内质网折叠受阻碍时,未折叠的蛋白聚集,激发 UPR,使一系列分子伴侣和蛋白质折叠所需修饰酶类表达上调,帮助其完成折叠和装配。如果这些蛋白仍不能正确折叠,则进入 ERAD 被降解。     

Protein Qnality Control

概述了蛋白质品质管理中涉及的分子伴侣、激发未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)和内质网相关性蛋白质 降解途径(ER-associated degradation,ERAD)等的研究进展,并探讨了该领域存在的问题以及发展前景.指出蛋白质的生命过程经历生成、折叠、组装和降解,每个过程都有严格控制.内质网中,各种蛋白质合成、折叠并经修饰形成具有一定构象的功能性蛋白.其在内质网折叠受阻碍时,未折叠的蛋白聚集,激发UPR,使一系列分子伴侣和蛋白质折叠所需修饰酶类表达上调,帮助其完成折叠和装配.如果这些蛋白仍不能正确折叠,则进入ERAD被降解.     

内质网分子伴侣GRP94对伪狂犬病毒增殖的调节作用

为探究葡萄糖调节蛋白94(GRP94)对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)增殖的影响,以及GRP94与PRV结构蛋白之间的相互作用。利用慢病毒转染构建GRP94基因过表达的BHK-21细胞,以及CRISPR/Cas9技术构建GRP94基因敲除的BHK-21细胞,检测PRV感染不同细胞的增殖水平,比较内质网应激相关蛋白表达水平,探索GRP94与PRV结构蛋白之间的互作关系。结果表明,GRP94基因过表达细胞株显著有利于PRV增殖,而GRP94基因缺失细胞株对PRV增殖无显著影响。蛋白免疫印迹结果显示,在GRP94基因缺失细胞株中,GRP78表达水平显著上调。免疫共沉淀结果表明,GRP94与gB、gD、gL具有相互作用。GRP94基因过表达有利于PRV增殖,检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)相关蛋白,研究GRP94在病毒增殖过程中的具体作用,可为PRV与内质网应激提供分子方面的研究基础,于对抗PRV病毒的感染具有重要意义。     

血凝素诱发内质网应激反应初探

为促进药物结构优化和改造，利用293T细胞进行转染及蛋白免疫印迹试验，研究病毒血凝素(HA)在内质网应激反应中的作用。结果表明，不同糖基化位点HA蛋白差异性表达明显，HA蛋白可诱发内质网应激反应，且不同的HA蛋白样中CHOP的表达量不同，从而引起内质网应激反应所导致的细胞凋亡也不同。     

前沿动态

正植物内质网相关蛋白降解新因子水稻种子是蛋白质和淀粉的储藏器官。在逆境环境下,灌浆期种子会积累大量错误折叠和非折叠蛋白,产生内质网胁迫,进而影响种子产量和品质。内质网相关蛋白降解(ERAD)途径在清除错误折叠蛋白以及内质网胁迫应答中发挥着重要作用。前期研究发现,胚乳特异性抑制小G蛋白基因SAR1的表达,会使分泌蛋白滞留在内质网中,导致水稻种子产生内质网胁迫。在此基础     

长春新碱激活内质网应激途径诱导人成纤维细胞凋亡的研究

在体外培养人皮肤瘢痕组织成纤维细胞时,用长春新碱(VCR)刺激后,采用TUNEL染色观察成纤维细胞的凋亡情况;用流式细胞技术测定成纤维细胞的凋亡率; Western blot检测细胞凋亡相关蛋白、内质网应激通路相关蛋白的变化,探讨VCR通过内质网应激途径诱导成纤维细胞凋亡。结果表明:细胞经VCR刺激后, TUNEL染色和流式细胞技术检测结果提示在VCR刺激后成纤维细胞明显发生凋亡。Western blot检测显示经VCR处理后成纤维细胞中促凋亡蛋白表达升高,内质网应激标记蛋白和内质网应激信号通道蛋白的表达上升;而内质网通道抑制剂4-苯基丁酸钠盐可有效逆转这一现象。这一研究提示VCR可诱导成纤维细胞凋亡,而这一现象可能是通过激活内质网应激途径而实现的。     

内质网小分子量热激蛋白的研究进展

热激可以导致热激蛋白的产生,包括产生由核基因编码的内质网小分子量热激蛋白。内质网小分子量热激蛋白是热激蛋白超家族成员,含有2个保守区域和内质网滞留序列;当植物受到内质网胁迫时,内质网小分子量热激蛋白能够保护内质网;对内质网小分子量热激蛋白与植物的耐热性、耐冷性关系进行了初步分析。     

褪黑素对HT-2毒素诱导的牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响

[目的]本文旨在探讨HT-2毒素对牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响,并评估褪黑素(Mel)是否能减弱HT-2毒素对颗粒细胞的毒性作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞,使用0、5、25、50、75和100 nmol·L~(-1) HT-2毒素分别处理细胞24 h,或使用褪黑素(100μmol·L~(-1))预处理12 h后再用HT-2毒素(50 nmol·L~(-1))处理24 h。采用CCK-8检测细胞增殖,用细胞免疫荧光技术检测细胞自噬,用RT-qPCR分析内质网应激与自噬关键基因CHOP、GRP78、Atg7和p62 mRNA表达,用Western blot检测内质网应激和自噬相关蛋白的表达。[结果]与对照组相比,HT-2毒素可导致卵巢颗粒细胞的增殖并呈浓度依赖性减少。免疫荧光染色显示HT-2毒素诱导的细胞自噬呈浓度依赖性增加(P0.01)。内质网应激相关基因CHOP和GRP78 mRNA及蛋白表达呈浓度依赖性上调(P0.01),自噬相关基因Atg7 mRNA表达呈浓度依赖性增加(P0.01),p62 mRNA及蛋白表达呈浓度依赖性减少(P0.01)。褪黑素预处理显著减轻了HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬。[结论]HT-2毒素可诱导牛卵巢颗粒细胞的内质网应激和自噬并呈浓度依赖性增加,褪黑素可以缓解HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬作用。     

转录因子bZIP60调控植物抗病抗逆的研究进展

未折叠蛋白反应(UPR)在植物的逆境胁迫、病原物侵染、生长发育中发挥重要作用,转录因子bZIP60是UPR信号之一。在明确了拟南芥、水稻、玉米、小麦等内质网应激时需肌醇酶(IRE1)介导bZIP60 mRNA剪接激活的基础上,归纳了bZIP60对逆境和病原物的响应机制,总结了IRE1/bZIP60信号在植物抗病抗逆中的研究进展。正常生长条件下,以前体蛋白bZIP60U的形式跨内质网膜。发生应激时,IRE1识别并剪切bZIP60 mRNA的双茎环结构,产生含转录激活域和核定位信号的活性蛋白bZIP60S,并在细胞核内形成二聚体,结合到应激反应相关基因的启动子,通过上调胁迫应答相关基因提高植株抗性。     

香猪H-FABP和UCP3基因的表达与IMF和血清FFA的相关性

为了研究心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid-binding protein,H-FABP)和解耦联蛋白3(uncoupling protein,UCP3)基因对贵州香猪肉质的调节作用,采用RT-PCR和免疫组织化学方法,以外二元杂交猪(大白×长白)为对照,研究H-FABP和UCP3基因在骨骼肌细胞中的表达和细胞定位,并与血清中游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)和肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量进行相关性研究.结果表明:香猪骨骼肌细胞中的H-FABP和UCP3基因表达量及其蛋白分布较杂交猪低,但血清FFA和IMF含量较杂交猪高.说明,香猪骨骼肌细胞中H-FABP的表达量不足,其肌细胞从血液中摄取FFA的量较少;同时香猪骨骼肌细胞中UCP3的表达量较低,因此,进入骨骼肌细胞的FFA消耗较少,大量存在于血液中,使脂肪沉积在肌肉细胞间或皮下等部位的机会增加.通过相关性分析表明,H-FABP基因的表达变化与IMF呈中度正相关,UCP3基因的表达变化与FFA呈中度负相关,表明,H-FABP和UCP3以蛋白量的表达变化为主影响骨骼肌细胞中的脂肪代谢,并以此调节香猪的肉质性状.     

葡萄糖调节蛋白78研究进展

葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78ku, GRP78)又称免疫球蛋白重链结合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein, Bip),是位于内质网上的一种重要分子伴侣,属热休克蛋白70家族的一员,GRP78分子及其DNA分子序列结构在许多生物物种中高度保守.GRP78在内质网中参与阻止内质网新生肽聚集、调节内质网钙稳态、抗内质网相关性细胞凋亡以及启动未折叠蛋白反应等.近年来发现,GRP78与多种疾病发生发展密切相关,GRP78生物学功能研究已经引起广泛关注.     

亮氨酸对早期断奶仔猪肝中内质网应激的影响

为探究日粮中亮氨酸水平对早期断奶仔猪(长×大)肝内质网应激的影响,利用透射电镜、细胞核质分离和蛋白质免疫印迹等技术,研究了在亮氨酸处理下肝细胞形态和内质网应激特征蛋白质的表达规律及对早期断奶诱导的肝内质网应激的影响。结果显示:在早期断奶诱导内质网应激模型中,与正常不断奶组相比,14日龄早期断奶组仔猪肝细胞中内质网口径增大,结构紊乱,同时细胞核内内质网应激相关蛋白XBP1的表达水平显著上调(P0.05);在体外Hep G2细胞培养模拟试验中,培养基中葡萄糖和亮氨酸的缺失都能显著上调细胞核内内质网应激相关蛋白ATF4和ATF6α剪切体蛋白的表达(P0.05),而在培养基中重补亮氨酸后,核内定位的ATF4蛋白出现了进一步的上调(P0.05)。不同亮氨酸水平日粮的饲喂试验结果显示,在21日龄未断奶条件下,日粮亮氨酸水平对ATF4和ATF6α剪切体在细胞核内的表达无显著影响(P0.05),而断奶24 h后,2.10%亮氨酸组仔猪肝细胞核内的ATF4蛋白表达水平显著高于1.66%亮氨酸组(P0.05)。上述结果表明,早期断奶能够诱导仔猪肝内质网应激的发生,而亮氨酸对早期断奶引发的肝内质网应激具有重要的调节功能。     

牛蒡子苷对小鼠原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶活性及细胞生长的影响

 【目的】以茶碱为参照,观察中药成分牛蒡子苷对原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶（Phosphodiesterase,PDE）活性及蛋白质合成的影响,探讨中药通过抑制PDE促进肌肉生长的作用及机理。【方法】分离1～3日龄ICR小鼠四肢肌肉用于骨骼肌原代细胞培养,在培养至第5～6天时向培养基中添加不同浓度的牛蒡子苷和茶碱,以不含牛蒡子苷和茶碱的培养基为阴性对照,继续培养24 h,采用HPLC、ELISA以及考马斯亮蓝法分别测定骨骼肌细胞cAMP PDE的活性、细胞内cAMP水平以及细胞总蛋白质合成。【结果】牛蒡子苷终浓度达到2.5 μg•ml-1、茶碱终浓度为20 μg•ml-1时均能极显著抑制原代培养骨骼肌细胞cAMP PDE的活性(P＜0.01）,显著提高细胞内cAMP水平（P＜0.05）,极显著促进肌细胞总蛋白质的合成（P＜0.01）。【结论】中药成分牛蒡子苷具有通过调节骨骼肌细胞内PDE的活性和cAMP水平,增加肌细胞蛋白质合成,促进骨骼肌细胞生长的作用。结果提示对PDE有抑制作用的中药有望成为促进动物生长的新型饲料添加剂。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基（proteasome subunit beta type-5, PSMB5）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting 法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNA si-RNA-PSMB5（si-PSMB5）,构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5（pcDNA-PSMB5）,采用（Lipofectamine）3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期（P<0.05）。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）;而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05）。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链(MyHC)蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期(P0.05)。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著(P0.05)。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组(P0.05);而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05)。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。     

真核细胞蛋白酶体的生物学功能及其调控机制研究进展

蛋白酶体广泛存在于真核细胞的胞质和胞核中,具有多种催化功能,可选择性降解胞内半衰期短和错误折叠的新生蛋白、应激损伤蛋白、突变的结构功能蛋白及细胞自身需要清除的其他特定蛋白,与基因转录、DNA损伤修复、细胞生长、凋亡和抗原递呈等重要生命活动紧密相关。真核细胞蛋白酶体作用重要,调控方式多样,因此,将就其构成、生物学功能及其调控机制进行综述。