滩羊骨髓间充质干细胞分离与培养

利用全骨髓法与差速贴壁法分离和培养滩羊骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察细胞形态及成脂诱导分化实验进行鉴定。结果显示原代培养的细胞呈圆形或三角形,24 h后大部分细胞均贴壁,7 d左右可达80%~90%融合,体外成脂诱导分化获得脂肪样细胞,油红染色为阳性。因此,全骨髓法与差速贴壁法可有效分离培养滩羊的骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法。     

小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离纯化及其定向诱导分化为神经元样细胞

比较了全骨髓法和密度梯度离心法分离、纯化小鼠骨髓间充质干细胞，并研究了不同培养基和血清对干细胞生长的影响以及小鼠骨髓间充质干细胞的神经分化潜能。结果表明，密度梯度离心法和贴壁法结合使用可以分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞；所获得的小鼠骨髓间充质干细胞具有诱导分化为神经元样细胞和脂肪样细胞的潜能，为小鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化的研究提供了技术支撑。     

犬骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

为了证明全骨髓贴壁法分离培养犬骨髓间充质干细胞的可行性,为后续移植试验提供活性良好的种子细胞,试验采用全骨髓贴壁法分离纯化犬骨髓间充质干细胞,并通过细胞形态观察、表面标记流式分析、体外诱导分化对细胞进行鉴定。结果表明:分离培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形、集落样生长,表面标记CD44呈阳性,CD34、CD45呈阴性,能够向成骨细胞和心肌样细胞分化。说明全骨髓贴壁法便捷可行,获得的犬骨髓间充质干细胞纯度高,增殖旺盛,分化能力良好。     

野猪骨髓间充质干细胞的分离培养与生物学特性

采用全骨髓培养法对野猪股骨中骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSC）进行分离、培养并传代,建立野猪骨髓间充质干细胞体外培养方法及对其生物学特性进行观察研究。结果显示,细胞形态呈梭形,漩涡状生长,生长曲线为典型S型,在诱导液作用下,可分化为成脂肪样细胞。结果表明,通过本方法能够分离到较纯的BMSC,为野猪资源保存和体细胞核移植提供技术支持。     

绵羊骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定

旨在分离绵羊骨髓间充质干细胞(sheep bone marrow mesenchymal stem cells, SBMSC),建立绵羊骨髓间充质干细胞系,为相关研究提供种子细胞。取新生健康绵羊肋骨为试验材料,利用贴壁法分离获得SBMSC;取生长良好的P3代细胞通过免疫荧光,进行CD73、CD90、CD105、CD106表型鉴定;取生长良好的P3代细胞分别进行成软骨、成脂、成骨方向的诱导,对诱导结果分别进行阿利新蓝、油红O和茜素红染色,鉴定分化结果。SBMSC呈成纤维样贴壁生长;体外培养P3代细胞表面标记物CD73、CD90、CD105和CD106完全符合标准;P3代细胞经软骨、脂肪、骨方向诱导3周后,经阿利新蓝染色,细胞呈亮蓝色;经油红O染色,细胞质内出现橙红色脂滴;茜素红染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节。说明SBMSC经体外诱导培养后可向软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞分化,并具有明显的成软骨、成脂和成骨表型,表明SBMSC具有多向分化潜能。通过贴壁培养法建立了SBMSC完整的体外培养体系,为绵羊育种等方面提供种子细胞。     

蒙古羊骨髓间充质干细胞的分离培养及多向诱导分化

本研究旨在建立蒙古羊骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)体外分离、纯化、增殖方法,诱导其向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。穿刺法抽取蒙古羊骨髓组织,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化BMSC,增殖,并测定其生长曲线及细胞倍增时间。对第3代蒙古羊BMSC进行成脂、成骨及成软骨诱导,观察诱导后的细胞形态。采用油红O、茜素红、HE等染色法在组织学水平对BMSC进行成脂、成骨和成软骨分化鉴定。结果显示,蒙古羊BMSC呈现均一梭形成纤维细胞样生长,生长曲线呈S型,生长增殖能力良好。在不同分化诱导之后,细胞呈现脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞的表型特征。表明获得的蒙古羊BMSC具有多向分化潜能,所分离细胞确为骨髓间充质干细胞。     

不同分离方法及首次换液时间对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响

探讨不同分离方法及首次换液时间对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物活性的影响。分别采用红细胞裂解法和全骨髓贴壁法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜观察细胞形态、台盼蓝染色检测细胞活性、记录首次传代时间、细胞免疫组化法鉴定CD90、CD44、CD34抗原表达;分别于培养12,24,48,72h首次换液,以后每2d换液1次,记录各组0~3代培养时间。结果显示,2种分离方法均能得到较均一的长梭形细胞,聚集成旋涡状均匀生长,CD90、CD44抗原表达阳性,CD34抗原表达阴性。其中红细胞裂解法所得细胞活性较全骨髓贴壁法高,首次传代时间短,差异显著(P0.05);24h首次换液各代达传代所需时间与其他各组比较差异极显著(P0.01),为最佳首次换液时间,可显著缩短细胞培养周期。这表明,采用红细胞裂解法,24h首次换液能够提高骨髓间充质干细胞的活性,缩短细胞培养周期。     

不同代次大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞成骨分化比较

本研究旨在观察不同代次骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外培养的生长特点和体外诱导成骨能力。通过密度梯度离心和贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,用含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并利用茜素红染色、碱性磷酸酶染色及PCR方法检测成骨细胞。结果表明骨髓及脂肪间充质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速。第5、10、15、20代BMSCs及ADSCs经诱导培养后茜素红染色呈阳性并且出现"矿化"、碱性磷酸酶活性强,随着细胞代次的递增,诱导后细胞碱性磷酸酶活性呈递减趋势;诱导后的两类细胞传代后细胞仍能继续分化,并形成正常的"矿化"结节,且碱性磷酸酶染色均弱于初次诱导。结果提示,BMSCs及ADSCs易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力强且成骨细胞传代培养仍具有成骨能力,适合作为再生医学骨组织工程的种子细胞。     

CRISPR系统促进脂肪干细胞成骨分化与抑制成脂分化的研究

本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3～5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。     

骨髓间充质干细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另一类具有多向分化潜能的干细胞。在一定的诱导条件下 ,这类细胞可定向分化为多种造血以外组织 ,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞、神经细胞等。骨髓间充质干细胞具有贴壁生长的特性 ,在体外易分离和扩增 ,还易于外源基因的转入和表达 ,在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。本文针对骨髓间充质干细胞的研究进展和在临床医学上的应用进行综述     

猪骨髓间充质干细胞分离培养和诱导分化脂肪细胞

采用全骨髓培养法分离猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)并传代培养;取第4代纯化的MSCs在成脂诱导培养基中诱导分化;分化的成脂细胞用形态学和油红O染色法进行鉴定;用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测成脂分化标志基因PPARγ2和LPL mRNA的表达情况。结果显示,分离培养的猪MSCs细胞经连续传代形态上无明显改变;MSCs在成脂分化培养液中诱导分化2d开始有少量脂滴出现,油红O染色成阳性,诱导18d成脂转化率可达59.8%;在诱导分化第5、10、15天时,PPARγ2mRNA相对表达量分别是(5.065±0.159)、(6.268±0.340)、(9.277±0.261),LPL mRNA的相对表达量分别是(10.995±1.473)、(13.130±0.712)、(15.762±0.934)。结果表明,用本诱导条件诱导猪MSCs向脂肪细胞分化,经形态学和油红O染色鉴定,成脂细胞分化率可达60%,且随分化时间的延长,脂肪细胞标志基因表达增加。     

CRISPR系统促进脂肪干细胞成骨分化与抑制成脂分化的研究

本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3~5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。     

犬脂肪间充质干细胞的分离培养及分化潜能研究

为获得犬脂肪间充质干细胞,本试验取犬腹股沟皮下脂肪组织,分别利用组织培养法和酶消化法分离犬脂肪来源间充质干细胞,对比观察不同来源细胞的形态和增殖特征,并通过诱导液促进细胞向成骨细胞和成脂细胞方向分化,检测其分化潜能。结果表明,通过组织培养法培养的青年犬脂肪组织,可获得大量脂肪间充质干细胞,该细胞生长旺盛,形态均一,可分化为碱性磷酸酶染色阳性的成骨细胞和油红O染色阳性成脂细胞。组织培养法分离培养犬脂肪间充质干细胞操作简单,可为细胞移植治疗等研究提供充足的细胞来源。     

蒙古马骨髓间充质干细胞的分离培养及多向分化潜能的研究

旨在探索一个高效分离和扩增蒙古马骨髓间充质干细胞的方法,并通过形态学和多向分化能力进行鉴定.抽取蒙古马骨髓标本,利用密度梯度离心和差异贴壁法分离MSCs,体外扩增后传代,进行相差显微镜形态学观察.在地塞米松、IBMX、胰岛素及罗格列酮的作用下向脂肪细胞诱导分化,以及在地塞米松、VitC、β-磷酸甘油等作用下向成骨细胞诱导分化.结果显示原代和传代细胞呈梭形成纤维细胞样外观,生长增殖能力良好.经定向诱导分化后,细胞分别呈现脂肪细胞、成骨细胞的表型特征.证明所纯化的细胞为尚未分化的基质细胞,而不是组织的成体细胞,它具有多向分化潜能.     

猪骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性

采集健康猪股骨骨髓,利用percoll梯度离心法分离单个核细胞,进行体外原代和传代培养,并用不同代数细胞进行了细胞生长能力、膜表面抗原(CD105、CD90、CD45)及诱导分化能力的检测.结果显示分离培养的单个核细胞贴壁生长,形态呈成纤维细胞样及涡旋状克隆团；细胞传代至第17代生长状况仍然良好；用F3代细胞进行膜表面抗原标记显示,CD90和CD105阳性表达率分别为(97.4±1.8)％和(99.6±0.9)％,而CD45阳性表达率仅为(1.8±0.55)％,证实这些细胞具有猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem Cells,MSCs)表面抗原；经地塞米松、维生素C和β-磷酸甘油等诱导F3代细胞,21d后出现钙物质沉积细胞群,用茜素红和Von kossa染色呈阳性,证实这些细胞已分化形成成骨细胞；经地塞米松、IBMX、胰岛素及吲哚美辛等诱导F3代细胞,21d后细胞质出现脂滴样结构,用油红O染色呈阳性,证实已分化形成成脂细胞；冷冻-解冻细胞的膜表面抗原及多能分化能力与未冻存细胞的检测结果基本一致.结果证实,从猪骨髓中分离培养及经传代扩增获得的贴壁细胞是纯化的MSCs.     

绒山羊毛囊干细胞的分离培养及诱导分化鉴定

试验旨在建立绒山羊毛囊干细胞体外分离培养方法,并对其生物学特性和多向分化潜能进行鉴定。利用两步酶消化法和差速贴壁法分离纯化毛囊干细胞,对其进行传代培养,测定生长曲线和克隆形成率,采用油红O和茜素红染色法对第5代毛囊干细胞向成脂和成骨分化情况进行鉴定。结果显示,分离得到的毛囊干细胞形态均一,体积小,呈典型的铺路石状生长,生长曲线呈S型,克隆形成能力强。成脂诱导后,细胞体积增大,细胞质增多,胞内出现小脂滴,诱导12 d后,脂滴逐渐增多,油红O染色呈阳性;成骨诱导后,细胞边缘模糊,出现颗粒状结节,经茜素红染色呈阳性。表明获得的绒山羊毛囊干细胞具有多向分化的潜能。     

大鼠胰腺间充质干细胞的分离鉴定及体外诱导成脂和成骨研究

从新生大鼠胰腺中分离出间充质干细胞(MSCs),研究其分化潜能,为胰腺疾病的干细胞移植治疗探寻新的细胞来源。无菌条件取出新生3 d的大鼠胰腺,通过Ⅴ型胶原酶消化获得细胞,常规培养传代、贴壁筛选法纯化细胞、吉姆萨染色观察细胞形态、流式细胞仪测定表面标志CD34和CD44;用成骨、成脂诱导剂鉴定其分化潜能。结果显示,纯化细胞在成骨诱导剂作用下被诱导成成骨细胞,在成脂诱导剂作用下被诱导成脂肪细胞。证明所纯化的细胞为尚未分化的基质细胞,而不是组织的成体细胞,它具有多向分化潜能。     

南阳牛骨髓间充质干细胞的分离培养及多向分化

本研究旨在建立南阳牛骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法,在此基础上研究其生物学特性和多向分化的能力。采用骨髓穿刺法取3月龄小牛的肋骨骨髓,分离培养BMSCs,传代培养并测定其生长曲线,RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2基因的表达,然后取P3 BMSCs分别向神经和脂肪细胞进行诱导分化,并利用组织学染色技术和RT-PCR技术进行鉴定。结果表明,分离得到的BMSCs大小均匀,多呈梭形的成纤维细胞样生长;RT-PCR可检测到干细胞因子Oct4、Nanog、Sox2的表达;不同代次细胞生长曲线呈S型,一般在第3天时进入指数生长期,第7天后进入平台期;成神经诱导后,甲苯胺蓝染色可见明显的尼氏体结构,RT-PCR检测ENO2和GFAP基因表达呈阳性;成脂肪诱导后,油红O染色后可见大量的脂滴存在,RT-PCR检测Leptin和PPAR基因表达呈阳性。试验证明,成功分离得到了南阳牛BMSCs,且其具有多向诱导分化潜能。     

荷斯坦牛骨髓间充质干细胞的分离培养和体外诱导分化的研究

本试验采用密度梯度离心法来分离纯化和体外培养荷斯坦牛骨髓间充质干细胞,并在体外分别诱导其分化为神经样细胞和脂肪样细胞.结果表明,采用密度梯度离心法可获得纯化度较高的荷斯坦牛骨髓间充质干细胞,并且在一定的诱导条件下能够分化为脂肪样和神经样细胞,为利用骨髓间充质干细胞作为核供体进行核移植的研究和动物遗传资源的保存研究奠定理论基础.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及肝内示踪

通过分离培养兔骨髓来源的间充质干细胞(MSCs),示踪其肝内移植命运,为MSCs的细胞治疗肝脏疾病提供理论依据和试验支持.采取全骨髓贴壁培养法分离培养兔骨髓MSCs,利用携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体感染MSCs,选择最优转染效率,并移植入经D-氨基半乳糖诱导的急性/亚急性肝衰竭受体兔体内,荧光显微镜下...