BDE-47对斑马鱼胚胎氧化应激与DNA损伤的毒性研究

以斑马鱼胚胎为受试对象,研究了2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE-47)对胚胎的氧化应激及DNA损伤。通过对不同浓度BDE-47(1、5、10、50μg·L~(-1))暴露5 d后胚胎/幼鱼体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S转移酶(GSH)的活性及丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量变化的分析以及Sod1、Ucp-2、Gstp2及Nqo1基因相对量表达的测定,考查BDE-47对斑马鱼胚胎/幼鱼的氧化应激效应;通过单细胞凝胶电泳(SCGE)对尾矩值的分析,探讨BDE-47对斑马鱼胚胎/幼鱼的DNA损伤。结果显示,BDE-47能够显著诱导ROS与MDA的产生,并呈现浓度效应依赖关系;50μg·L~(-1)BDE-47能够显著增加SOD与CAT的活性,降低GSH的浓度。BDE-47暴露后50μg·L~(-1)暴露组基因Ucp-2的表达显著上调4.12倍(p0.01),Gstp2与Nqo1表达分别显著下调至对照组的0.62倍与0.55倍(p0.01),而基因Sod1相对表达量没有显著变化。同时,5、10、50μg·L~(-1)暴露组胚胎/幼鱼尾矩值显著增加并伴随着ROS的浓度升高。结果表明,BDE-47能够诱导斑马鱼胚胎/幼鱼产生氧化应激,ROS是诱发胚胎发生DNA损伤的导火索。     

慢病毒包装体系的建立与体外表达

为筛选出最佳的慢病毒转染处理时间,研究三质粒对慢病毒包装的最佳浓度配比,以及对293T细胞的细胞转染率和滴度,通过脂质体与Fugw质粒混合后转染293T细胞,观察293T细胞的形态和荧光表达量。结果表明:转染6h组的细胞形态略好于8h;转染8h组和6h组的转染率均极显著高于10h组(p0.01),但彼此间差异不显著(p0.05);质粒配比为4:3:2时,慢病毒滴度最高,达3.795×107TU·m L-1,经离心后滴度与离心之前相比能提高100倍。不同浓度的质粒配比对293T细胞转染率和滴度方面,B组(4∶3∶2)的转染率最高、C组(3∶2∶1)最低、A组(5∶4∶3)介于二者之间,3组间彼此差异极显著(p0.01);转染后B组的滴度极显著高于A组和C组(p0.01),而A组和C组间差异不显著(p0.05)。感染293T靶细胞存在EGFP基因表达。利用10μL脂质体2000介导4μg的Fugw质粒转染293T细胞的最佳时间为6h;当Fugw∶△8.2∶Vsvg为4∶3∶2时,慢病毒转染293T细胞的效果最好。     

无乳链球菌对罗非鱼粘液的粘附特性

利用间接ELISA方法研究罗非鱼不同部位的粘液、作用时间、温度、p H及盐度等因子对无乳链球菌粘附作用的影响。结果表明:无乳链球菌对罗非鱼不同部位粘液的粘附能力受温度、粘附时间和p H值影响较大,受盐度影响较小。孵育温度为35℃、孵育时间为120 min时,无乳链球菌对肠道粘液的粘附能力最强,粘附量达到4.052×10~7cfu·m L~(-1);其次是体表粘液,粘附量为6.480×10~6cfu·m L~(-1);鳃粘液的粘附能力最弱,为2.825×10~6cfu·m L~(-1)。当孵育时间少于180 min时,粘附量与孵育时间呈正相关;粘附量在35℃下孵育180 min时,趋于饱和,达到5×10~8cfu·m L~(-1)。无乳链球菌对不同部位粘液粘附的最适p H值不同,肠道粘液、体表粘液和鳃粘液粘附力最强的p H值分别为5.0,7.0和8.0。     

斑马鱼胚胎经丙草胺暴露后对其仔鱼致畸效应的研究

为探讨斑马鱼胚胎暴露于丙草胺后对斑马鱼仔鱼的致畸效应和致畸机理,研究了斑马鱼胚胎暴露于0.50、1.00、1.50 mg·L~(-1)丙草胺染毒液120 h后仔鱼的畸形表型及比率,并通过检测与畸形器官发育相关的基因表达探讨致畸机理。结果发现,丙草胺暴露后诱导斑马鱼仔鱼出现心包囊肿、躯干弯曲、游囊关闭等畸形表型,随着暴露浓度的增加,各畸形症状比例增大。1.00、1.50 mg·L~(-1)暴露组仔鱼心包囊肿率分别为15.56%(P0.05)、25.56%(P0.01),脊柱弯曲率分别为27.78%(P0.01)、35.56%(P0.01);0.50、1.00、1.50 mg·L~(-1)暴露组仔鱼游囊关闭率分别为20%(P0.05)、37.78%(P0.01)和60%(P0.01)。丙草胺显著降低了心脏发育相关基因Tbx2[1.00 mg·L~(-1)(P0.01)、1.50 mg·L~(-1)(P0.05)],骨骼发育相关基因BMP-2[1.50 mg·L~(-1)(P0.05)]、BMP-4[1.00 mg·L~(-1)(P0.01)、1.50 mg·L~(-1)(P0.01)],游囊发育相关基因shha[1.50 mg·L~(-1)(P0.05)]、ihha[1.00 mg·L~(-1)(P0.05)、1.50 mg·L~(-1)(P0.05)]的表达水平。研究表明,丙草胺通过影响心脏、骨骼和游囊相关基因的表达引起斑马鱼仔鱼的以上器官发育异常。     

转基因斑马鱼在镉免疫毒性研究中的应用

为开发转基因斑马鱼技术在环境污染物免疫毒性研究中的应用,以转基因斑马鱼Tg(lysC:DsRed2)-Lyz fish为模型,利用斑马鱼胚胎发育技术和定量实时RT-PCR技术,探讨了Cd对斑马鱼仔鱼的免疫毒性及其作用机制。结果表明,0.01μmol·L~(-1)CdCl_2即可显著抑制转基因斑马鱼胚胎的孵化(P=0.013),当暴露浓度增大到0.1μmol·L~(-1)时,斑马鱼胚胎24 h血流障碍和52 h孵化抑制这两个毒性效应都大幅增强,且剂量-效应关系显著。0.1μmol·L~(-1)CdCl2使得溶菌酶(lysozyme C,lyz)标记的斑马鱼仔鱼体内中性粒细胞数量增多,且趋向肝脏部位聚集。免疫毒性的作用机制与斑马鱼仔鱼体内金属硫蛋白相关基因(dMT)和炎症相关基因(serp、tnf)表达的诱导,以及癌症抑制相关基因(ccgn1、chk2、p53)表达的抑制有相关性。研究表明,转基因斑马鱼Tg(lysC:DsRed2)在重金属污染物免疫毒性评价中具有重要意义。     

表达绿色荧光蛋白的猪胚胎生殖细胞分离

以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体，对处于快速增殖期的8株猪胚胎生殖(EG)细胞(4—9代)进行转基因试验。用1μg DNA和2μL LipofecTamine 2000转染EG细胞后，共获得4株转染EGFP基因的EG细胞系(EG—EGFP)，可发出强绿色荧光；EG—EGFP细胞连续培养2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG—EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中，共注射135枚胚胎，其中112枚存活并发育至囊胚(83．0％)；86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞，其中57枚囊胚在内细胞团(ICM)上发现有EG—EGFP细胞。     

miR-505慢病毒表达载体的构建

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。     

水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究

[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20～22 h后随机分为2组:①在体外受精7～10 h或18～20 h后向卵胞质内注入约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②分别注入单个精子与约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P0.05),且IVF 7～10 h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18～20 h(P0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10 h注射的效果优于IVF后18～20 h注射。     

水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究(英文)

[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20～22h后随机分为2组,①在体外受精7～10或18～20h后向卵胞质内注入约7.5pL50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②则分别注入单个精子与约7.5pL50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P>0.05),且IVF7～10h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18～20h(P<0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10h注射的效果优于IVF后18～20h注射。     

饲料添加凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌对生长猪的生长性能影响

选择初始体重30.2±0.3 kg试验猪28头随机分为4个处理组:对照组添加杆菌肽锌40 g·t~(-1);试验组1添加饲用凝结芽孢杆菌2×10~6cfu·g~(-1);试验组2添加饲用枯草芽孢杆菌2×10~6cfu·g~(-1);试验组3同时添加2×10~6cfu·g~(-1)凝结芽孢杆菌与2×10~6cfu·g~(-1)枯草芽孢杆菌,用于研究饲料添加凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌对30～60 kg阶段生长猪的生长性能影响。试验结果表明,平均日增重、饲料增重比指标,试验组1显著优于对照组(P0.05),且对照组、试验组2和试验组3之间差异不显著(P0.05)。饲料干物质与总能表观消化率,试验组1最高,其他3个处理组之间差异不显著(P0.05)。试验结果表明,与使用杆菌肽锌相比,单一添加饲用凝结芽孢杆菌2×10~6cfu·g~(-1)的生长猪生长性能最佳;然而,单一添加同样剂量的枯草芽孢杆菌、或组合添加枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌,没有获得生长性能的进一步改善。     

日粮添加枯草芽孢杆菌水平对蛋鸡生产性能、蛋品质和排泄物水分的影响

试验旨在评估日粮添加枯草芽孢杆菌(BS)水平对蛋鸡生产性能、蛋品质和排泄物水分的影响。选取25~45周龄海兰W-36蛋鸡240只,随机分成4组,每组10个重复,每个重复6只鸡。试验1组(对照组)不添加益生菌;试验2组在基础日粮中添加枯草芽孢杆菌8×105cfu·g-1;试验3组添加枯草芽孢杆菌4×105cfu·g-1;试验4组添加枯草芽孢杆菌3×105cfu·g-1。与对照组相比,饲粮添加枯草芽孢杆菌8×105cfu·g-1组显著提高产蛋率2.63%(P0.05),显著提高蛋重3.96%(P0.05)。日粮添加不同浓度的枯草芽孢杆菌对料蛋比没有显著影响(P0.05)。添加枯草芽孢杆菌组排泄物中干物质含量比对照组平均增高4.67%(P0.05)。日粮添加枯草芽孢杆菌8×105cfu·g-1组提高了蛋鸡产蛋量,减少了排泄物水分。     

银杏GbSAD基因对非生物胁迫的响应及原核表达

以悬浮培养的银杏愈伤组织为材料,采用荧光定量RT-PCR研究了Gb SAD基因在高盐和不同外源激素处理条件下的表达模式。结果表明:外施100μmol·L~(-1)水杨酸(SA)后,Gb SAD表达量发生显著变化;外施100μmol·L~(-1)脱落酸(ABA)、40μmol·L~(-1)乙烯利(ETH)、100μmol·L~(-1)茉莉酸甲酯(Me JA),Gb SAD表达量未呈现显著变化;外施200 mmol·L~(-1)氯化钠(Na Cl),Gb SAD表达量小幅度降低。Gb SAD组织表达分析表明基因在根、茎、叶、雄花和雌花中均有表达,在叶中表达量最高。SAD氨基酸序列同源比对发现,Gb SAD与其他被子植物的序列相似度较高,表明Gb SAD在进化上较保守。将银杏Gb SAD克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)并诱导表达。结果表明,Gb SAD蛋白在1 mmol·L~(-1)IPTG的诱导下,培养2 h即能实现融合蛋白的高效表达,为进一步纯化目的蛋白及研究其功能奠定了基础。     

睾丸注射慢病毒生产转基因鸡的研究

【目的】采用睾丸注射慢病毒的方法生产转基因鸡以提高转基因效率,使转基因鸡的批量生产变得简单可行。【方法】用磷酸钙沉淀法包装慢病毒,对慢病毒包装体系中的质粒总量和HN Buffer的pH值进行优化,以包装出滴度较高的慢病毒;然后将慢病毒注射到受精鸡蛋的胚胎中验证其活性;最后,将慢病毒注射到8日龄公鸡的睾丸内,待其性成熟以后,将精液DNA呈阳性的公鸡与非转基因母鸡进行交配生产出转基因鸡。【结果】当90mm培养皿中质粒总量为50μg、HN Buffer的pH值为7.05时慢病毒的包装效率最高,在该条件下包装出的慢病毒滴度高达7.5×107 TU/mL;采用慢病毒胚胎注射途径成功地生产出增强绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)转基因鸡;采用慢病毒睾丸注射途径生产的转基因鸡后代中能检测到eGFP目的基因,但未检测到其相关的表达。【结论】慢病毒睾丸注射途径能够将外源基因整合到精原干细胞中,并遗传给后代。     

诺考达唑对体外小鼠卵裂球M期阻抑及后续发育的影响

为获得更多具有后续发育能力的小鼠M期卵裂球,以测定细胞间期和M期的重编程因子表达情况,用不同浓度的诺考达唑(Nocodazole)对小鼠1-cell胚胎及2-cell胚胎进行了不同时间的处理,筛选出了控制卵裂球停留在M期的最佳处理浓度及处理时间。结果表明:0.10,0.15和0.20μg·m L-1的诺考达唑可有效且可逆地使小鼠1-cell胚胎或2-cell胚胎阻抑在M期;在诺考达唑去除后的1~2h,胚胎细胞重新恢复有丝分裂,完成卵裂;0.10μg·m L-1的诺考达唑处理12h可很好地将1-cell胚胎阻抑于M期,且对胚胎的后续发育影响不大;0.20μg·m L-1的诺考达唑处理18h对2-cell胚胎阻抑效果最好,而解除诺考达唑处理后3h内的胚胎发育能力略低于0.15μg·m L-1处理组,但差异不显著(p0.05)。由于两组(0.15μg·m L-1组和0.20μg·m L-1组)对2-cell胚胎阻抑效果及发育能力两方面均差异不显著(p0.05),因此选用0.15μg·m L-1的诺考达唑处理2-cell胚胎。用0.10μg·m L-1和0.15μg·m L-1的诺考达唑分别对小鼠的1-cell胚胎及2-cell胚胎处理12h和18h,可获得更多有发育能力的小鼠M期卵裂球。     

铝胁迫下高粱BTx623幼苗的形态及生理响应特征

采用不同浓度铝离子(0,25,50,100μmol·L~(-1),p H=4.5)胁迫处理高粱幼苗,以探究铝胁迫对高粱BTx623幼苗生长发育的影响。结果表明,与对照相比,不同浓度铝处理后,高粱幼苗株高无显著变化,但其根系长度和相对伸长率显著下降;25μmol·L~(-1)铝胁迫下幼苗的鲜重、干重、叶绿素含量和根系脱氢酶活性分别增加了11.4%,50.0%,32.1%和32.5%,而50和100μmol·L~(-1)铝胁迫下幼苗鲜重、干重、叶绿素含量和根系脱氢酶活性均有不同程度的下降。随着铝胁迫程度加大,根尖铝积累量、根系过氧化氢(H_2O_2)和丙二醛(MDA)的含量逐渐增加。25μmol·L~(-1)铝胁迫下根系超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性分别上升了44.5%和33.7%,过氧化物酶(POD)活性变化不显著,而100μmol·L~(-1)铝胁迫下这3种酶活性均显著降低。综上,25μmol·L~(-1)铝胁迫下高粱BTx623幼苗根系抗氧化酶活性增强,对鲜重、干重和叶绿素含量亦具有促进作用,但对根系伸长具有显著抑制作用;而50和100μmol·L~(-1)铝胁迫对高粱BTx623幼苗地上及地下部分均具有较强的抑制作用。     

生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌的室内活性评价

为筛选出可用于苹果轮纹病防治的生物源杀菌剂,采用菌丝生长速率法测定了9种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制效果。结果表明:测试药剂对苹果轮纹病菌丝生长均有较好的抑制效果。其中,室内毒力最强的3种药剂是50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌(WP)、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌(WP)和300亿cfu/g解淀粉芽孢杆菌(WP),EC50分别为3. 155×10~(-2)μg/m L、3. 429×10~(-2)μg/m L和8. 856×10~(-2)μg/m L;室内毒力相对较弱的为1000亿cfu/g荧光假单胞杆菌(WP)、5%香芹酚(AS)、大蒜油(EC)、0. 3%丁子香酚(SL)、1%蛇床子素(EW)、3亿cfu/g哈茨木霉菌(WP),EC_(50)分别为7. 556μg/m L、1. 480×10μg/m L、1. 719×10μg/m L、5. 901×10μg/m L、6. 601×10μg/m L、1. 181×10~2μg/m L。综上,50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌(WP)、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌(WP)和300亿/g解淀粉芽孢杆菌(WP)有望成为防治苹果轮纹病的候选生物源杀菌剂。     

p66Shc对绵羊早期胚胎发育的影响

[目的]探讨p66Shc对绵羊早期胚胎发育的影响.[方法]以受精后28 h为节点,将早期胚胎分为早卵裂胚胎和晚卵裂胚胎,观察不同时期卵裂胚胎的进一步发育情况,同时通过实时荧光定量PCR检测不同来源的4-8细胞阶段胚胎中p66Shc基因的表达水平;利用siRNA分子干扰技术将特异性siRNA分子通过显微注射到绵羊合子细胞质中,以敲减早期胚胎p66Shc基因;通过免疫荧光技术检测p66Shc基因对绵羊早期胚胎发育过程中活性氧(ROS)和氧化应激标记物(8-OHdG)表达的影响.[结果]早卵裂胚胎的囊胚发育率显著高于晚卵裂胚胎(P<0.05);晚卵裂胚胎中p66Shc mRNA表达水平显著高于早卵裂胚胎(P<0.05);将绵羊早期胚胎中的p66Shc基因敲减后,与对照组相比,其胚胎内p66Shc mRNA水平、p66Shc蛋白水平显著降低,ROS和8-OHdG水平显著低于对照组(P<0.05);基因敲减后桑椹胚发育率显著升高(P<0.05).[结论]低水平的p66shc可以提高绵羊早期胚胎对氧化应激的抵抗力,并进一步提高其发育能力.     

亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响

收集屠宰场水牛卵巢卵母细胞,在卵子体外成熟和受精后胚胎体外发育过程中分别添加0(对照组),10,50,100和200μmol·L-1的亚麻酸,探究亚麻酸对水牛卵母细胞核成熟率、受精卵的分裂率和植入前胚胎体外发育的影响。结果显示:在水牛卵母细胞体外成熟液中添加亚麻酸,添加浓度50μmol·L-1组的核成熟率(74.18%)显著高于对照组和其他实验组(P0.05),囊胚率(33.24%)显著高于对照组和10μmol·L-1亚麻酸组(P0.05)。在胚胎培养液中添加50μmol·L-1亚麻酸组的囊胚率(34.52%)显著高于对照组和100μmol·L-1亚麻酸组(P0.05);同时在成熟液和胚胎培养液中添加亚麻酸,添加浓度200μmol·L-1组的分裂率显著高于对照组(P0.05),而各组间的囊胚率和D7囊胚比率均差异不显著。结果表明,单独在水牛卵母细胞体外成熟液和胚胎培养液中添加50μmol·L-1亚麻酸能有效促进水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育。     

壳寡糖对小鼠胚胎体外发育的影响

本研究旨在通过向小鼠体内受精和体外受精原核胚胎的培养基中添加壳寡糖(对照组:0μg·m L-1;试验组:5、10、50、100和200μg·m L-1),研究其对小鼠胚胎着床前发育效率(卵裂率、囊胚率)和囊胚质量(囊胚总细胞数、内细胞团数(ICM)与总细胞数的比率)的影响。结果表明,对于自然受精胚胎,添加10μg·m L-1壳寡糖组的囊胚总细胞数显著高于对照组(P0.05),添加200μg·m L-1壳寡糖组的卵裂率和囊胚率均显著低于对照组(P0.05)。对于体外受精胚胎,添加10μg·m L-1壳寡糖组的囊胚率显著高于对照组(P0.05),添加200μg·m L-1壳寡糖组的囊胚率显著低于对照组(P0.05)。本试验表明,在化学限定培养基中添加适量的壳寡糖有利于改善小鼠胚胎的质量,但高剂量的壳寡糖可能不利于小鼠胚胎的早期发育。     

添加乳酸菌和糖蜜对秸秆生物饲料的发酵品质及In vitro干物质消失率和瘤胃甲烷生成的影响

采用小规模发酵法,试验处理包括无添加组(对照组)、乳酸菌、糖蜜以及乳酸菌和糖蜜共同添加组。30 d后开封,乳酸菌和糖蜜添加组感官评分良好;乳酸菌、乳酸菌和糖蜜混合添加组的p H低于(P0.05)对照组和糖蜜添加组。4个处理组的乳酸菌数量均在106~107(cfu·g~(-1))以上,3个添加组未检出酪酸菌和大肠杆菌,而酵母菌、耐热菌数量分别为102~106和103(cfu·g~(-1));对照组中大肠杆菌和酵母菌均为106(cfu·g~(-1))。糖蜜、乳酸菌以及二者共同添加组的In vitro干物质消失率显著高于对照组,而只有乳酸菌添加组的瘤胃甲烷生成量低于对照组。由此可见,添加乳酸菌、糖蜜以及二者混合添加均有助于秸秆发酵,抑制有害细菌的生长,能够得到高品质的玉米秸秆生物发酵饲料,并且添加乳酸菌可以降低秸秆生物饲料的In vitro瘤胃甲烷生成量。