检测新城疫病毒的纳米PCR技术建立与初步应用

根据Gen Bank登录的新城疫病毒(NDV)M基因核苷酸序列设计引物,建立了NDV纳米PCR检测方法。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对NDV的最低核酸检出量分别为27 pg,比传统PCR敏感10倍,可扩增出297 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、传染性法氏囊病毒与传染性支气管炎病毒的检测结果均为阴性。该方法可用于新城疫病毒的临床快速检测与流行病学调查。     

一步法SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

为了建立鸡传染性支气管炎病毒快速、敏感的检测方法,本研究利用RT-PCR技术扩增出鸡传染性支气管炎病毒M基因中134bp的保守序列,并克隆到pMD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了IBV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达3.5×10~1拷贝,与禽呼肠孤病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床IBV的检测。     

鸡IBV、NDV和AIV多重RT-PCR检测方法的初步建立

根据鸡传染性支气管炎病毒M基因、禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,初步建立了针对鸡传染性支气管炎(IB)、新城疫(ND)和禽流感(AI)的多重RT-PCR鉴别诊断方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的3对引物可对同一样品中的IBV、NDV和AIV进行特异性扩增,所扩增的目的片断的长度分别为333bp(IBV)、438bp(NDV)和196bp(AIV);建立的多重RT-PCR检测方法能够检测出1ng/μLAIV、1ng/μLNDV和10ng/μLIBV的cDNA,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。本研究所建立的多重RT-PCR方法可用于上述3种鸡病毒性呼吸道疾病的快速鉴别诊断,在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。     

鸽新城疫病毒可视化LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种简便、快速,适用于基层检测鸽Ⅰ型副黏病毒的方法,研究针对鸽Ⅰ型副黏病毒全基因组保守序列,设计了1组可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型分离株的环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件及体系,建立鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法。结果显示：建立的鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型鸽新城疫病毒,与H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、禽网状内皮组织增殖病病毒、小鹅瘟病毒以及禽白血病病毒以及新城疫病毒La Sota疫苗株均无交叉反应,最低检测限为10¹ copies/μL。研究表明所建立的鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法快速、简便,特异性强,灵敏度高,可应用于基层快速检测鸽Ⅰ型副黏病毒。     

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

新城疫病毒RT-PCR一步法的建立及应用

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法,根据GenBank上登录的NDV F基因序列,利用生物学软件设计合成一对特异性引物,通过反应条件的优化,建立了检测NDV的RT-PCR一步法.该方法对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ngRNA.临床初步应用显示该检测方法特异性强、敏感性高,可以用于新城疫病毒的临床快速检测.     

荧光定量RT-PCR检测鸡新城疫病毒方法的建立及应用

针对新城疫基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测NDV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如鸡传染性支气管炎(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克氏病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.9×101拷贝/!L的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于3%。结果表明,本研究所建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于新城疫的定量检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。     

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.     

鸭圆环病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中DuCV基因序列,在保守区设计了6条特异性引物,并对反应条件进行优化,建立了一种适用于鸭圆环病毒（DuCV）的环介导等温扩增快速检测方法（LAMP）。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎、鸭副黏病毒均无扩增反应;且扩增反应只需在常规水浴锅中进行,1小时内即可完成反应;对DuCV模版DNA的最小检测限为10龟,灵敏度是一步法PCR的1000倍。本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行DuCV的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,采用针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因保守序列设计的特异引物,优化反应条件,建立了IBRV LAMP检测方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的LAMP方法具有良好的特异性,其检出灵敏度为10~3 copies/μL,仅需1 h即可肉眼观察检测结果。结果表明,本试验建立的LAMP方法可用于IBRV的进出口检疫。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法,用于快速检测传染性法氏囊病,从而评估禽类动物健康情况,试验针对传染性法氏囊病病毒VP3序列设计引物,优化反应时间、温度、体系等获取最佳反应参数,对建立的传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的灵敏度、颜色变化、特异性进行研究并应用该方法检测临床疑似病料。结果表明:传染性法氏囊病病毒在60℃75 min和80℃10 min条件下目标核酸区段大量扩增,以此条件成功建立针对鸡传染性法氏囊病病毒的RTLAMP检测方法;在模板浓度为994.9 ng/μL并进行10倍稀释的情况下,所建立的RT-LAMP检测方法具有极高的灵敏性,可以检测到99.49 fg/μL的样品,比RT-PCR方法的灵敏度高100倍左右;在RT-LAMP的检测结果中加入Gene Finder可使阳性结果变为绿色;该方法只有鸡传染性法氏囊病病毒发生反应,表现出良好的特异性;在临床疑似病料检测中,RT-LAMP检测方法的检出率高达93.75%,比RT-PCR检测方法高25.00%。说明试验建立的传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法具有简便、灵敏、快速、强异性高等优点,可用于临床鸡传染性法氏囊病病毒的快速检测。     

B亚型禽偏肺病毒RT-LAMP快速检测方法的建立与应用

利用Primer Explorer V4在线软件设计针对B亚型禽偏肺病毒(aMPV)F基因的特异性引物,并从反应时间、温度、各组分浓度等方面优化了反应体系和反应条件,建立了B亚型aMPV逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法.该方法能够在63℃条件下1h内实现B亚型aMPV F基因片段的特异性扩增,与其他病毒,如H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)等的核酸无交叉反应.反应结果可直接用肉眼判断.对质粒DNA的最小检测量为1×102拷贝/μL.利用建立的检测方法对20份疑似aMPV样品进行检测,其阳性检出率为10％.结果表明,建立的B亚型aMPV RT-LAMP检测方法具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点,可应用于相关疾病的临床诊断.     

H5、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒的多重RT-PCR检测

根据Genbank注册发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的HA基因序列,设计多对引物,每种病毒各筛选出一对特异性好、灵敏度高的引物,其中FP1/FP2扩增H5亚型AIVHA基因片断长为545bp;P3/P4扩增H9亚型AIVHA基因片断长为321bp;P11/P22扩增NDVHA基因片断长为672bp。用RT-PCR方法,通过特异性试验、灵敏度试验,H5、H9亚型AIV和NDV引物的灵敏度分别达到了1:104、1:108、1:104稀释度,与传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性喉气管炎(ILTV)、传染性鼻炎(IC)、霉形体(MS)、H1N1猪流感等抗原无交叉反应。实验结果表明,本研究建立了检测H5、H9亚型AIV和NDV的多重RT-PCR方法,混合引物的最佳退火温度为50℃,鉴定检测仅需4小时。     

荧光定量PCR检测鸡马立克氏病血清1型病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的鸡马立克氏病血清1型病毒(MDV-1)病原检测方法,试验采用针对MDV-1基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测MDV-1核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)均不发生交叉反应;该方法可检测到4.6×101拷贝/L的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明所建立的Real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于MDV-1的定量检测。     

沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速检测,根据沙门氏菌特异性invE、hilA、invA、hut基因编码区序列,分别设计合成4套引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增检测方法。本方法对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到101CFU/mL (细菌浓度),其灵敏度比普通PCR高10倍且反应结果易于观察。以6种沙门氏菌和8种非沙门氏菌细菌DNA为模板进行LAMP扩增检测,并无交叉反应。结果显示,设计的LAMP引物组和建立的沙门氏菌的LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点,可应用于动物和食品样品中肠道沙门氏菌6个亚种的快速检测。     

一步法多重RT-PCR检测新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和传染性法氏囊病病毒方法的建立和应用

根椐GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒[AIV(H9)]和传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的NDV、AIV(H9)和IBDV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增NDV的466bp、AIV(H9)的685bp和IBDV的244bp的特异性片段,而对其他4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10pg的NDV、10pg的AIV(H9)和1pg的IBDV模板。用53份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速及准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

禽腺病毒-Ⅰ群、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立

为快速检测禽腺病毒-Ⅰ群(FAV-I)感染,且能有效区分常见混合感染的新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV),本研究建立了多重PCR诊断方法。根据GenBank发表的FAV-Ⅰ的Hexon基因、NDV的F基因和IBV的N基因分别设计了3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化建立多重PCR诊断方法,并对该方法进行了特异性和敏感性研究,且对临床样本进行检测。结果发现,本研究建立的多重PCR方法可准确扩增出大小为895 bp(FAV-I)、1 600 bp(IBV)和529 bp(NDV)的特异性片段;3种引物最佳浓度分别为3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL,最佳退火温度为55℃;该方法对3种病毒的最低检测限分别为1.46×10~5拷贝/μL、8.93×10~2拷贝/μL和2.11×10~4拷贝/μL;且该方法不能扩增出减蛋综合征病毒、马立克病毒、鸡传染性贫血病毒和H9亚型禽流感病毒等,临床样品检测结果与单项PCR结果相同。表明本研究建立的多重PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可有效地区分FAV-I、NDV、IBV。