草莓microRNA的RT-PCR鉴定

 【目的】microRNAs（miRNAs）在植物的生长发育过程中起着重要作用,本研究旨在建立一种快速准确地鉴定草莓中保守miRNA的方法。【方法】以草莓叶片为试材,在利用改进的CTAB法成功富集小于150 bp的小分子RNA的基础之上,采用3′端加接头、5′端和3′端两端加接头、利用茎环等3种RT-PCR策略来检测鉴定草莓中保守miRNA,同时比较总核酸、总RNA和小分子RNA等不同种类的模板对利用茎环RT-PCR检测miRNA的影响。【结果】对于植物中20种miRNAs,通过3′端加接头方式鉴定出7种;通过两端加接头方式鉴定出1种;而利用茎环的方式鉴定出15种。分别以3种核酸为模板的茎环RT-PCR的扩增效果没有差异。【结论】总核酸的提取是最快速最简单的,因此,以总核酸为模板,利用茎环RT-PCR是鉴定植物中miRNA的最简便快速而有效的方法,这种方法的可行性已在苹果、葡萄等植物上得到验证。     

烟草microRNA827及其靶基因的鉴定与分析

[目的]本文旨在明确林烟草(Nicotiana sylvestris)microRNA827(miR827)及其靶基因的表达调控特征,揭示其靶基因在进化上的变异性及其功能,为全面解析植物磷信号途径提供新的证据。[方法]基于本课题组前期工作从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆到的miR827基因序列,采用生物信息学手段结合RACE和RT-q PCR,以及本氏烟草叶片表皮细胞瞬时表达和酵母突变体回补试验,对林烟草miR827的靶基因进行克隆,对miR827及其靶基因的表达模式、靶基因的定位和功能进行研究。[结果]获得林烟草miR827两个靶基因Ns-SPX-MFS1/2的c DNA全长序列,发现Ns-miR827受缺磷诱导表达,而Ns-SPX-MFS1和Ns-SPX-MFS2响应缺磷信号分别发生下调和上调。Ns-SPX-MFS1/2均定位于液泡膜和细胞核。此外,不论Ns-SPX-MFS1/2的开放阅读框全长或截去SPX结构域的2个基因片段均能回补酵母磷吸收突变株。[结论]miR827及其靶基因调控模块在物种进化中存在复杂的变异性,Ns-SPX-MFS1/2具有转运磷的活性,其可能通过介导液泡和细胞质间磷的转运实现对植株磷稳态的调控。     

草莓FaPYL5基因的鉴定及功能分析

为探究ABA受体PYL5在非呼吸跃变型果实成熟过程中的调控作用,本研究通过生物信息学对草莓Fa-PYL5进行了确定和氨基酸序列的分析;通过荧光定量PCR对FaPYL5进行了不同时期的表达量测定;通过原核表达及蛋白纯化技术得到纯化的FaPYL5蛋白并进行了鉴定;通过ITC、亚细胞定位和瞬时转基因对FaPYL5进行了功能鉴...     

家蚕microRNA 7靶基因Bmhairy的鉴定和转录表达模式

【目的】microRNA是一类长约22个碱基的非编码RNA,通过与其靶基因的特异性结合来调控新陈代谢和生长发育等多种生命活动。鉴定家蚕(Bombyx mori)Bmhairy,比较Bmhairy和bmo-miR-7的表达模式,验证Bmhairy是否为bmo-miR-7的靶基因,为研究家蚕的变态发育机制提供线索。【方法】 用家蚕胚胎反转期的总RNA反转录合成的cDNA模板,克隆Bmhairy编码区（coding DNA sequence,CDS）和3′端非翻译区（3′ untranslated region,3′UTR）并进行序列分析。基于荧光定量PCR和芯片数据比较bmo-miR-7和Bmhairy的表达模式。利用RNAhybrid和MiRTif,预测和分析Bmhairy的mRNA 3′UTR上bmo-miR-7的靶位点。构建荧光素酶报告基因载体,用家蚕胚胎细胞系（BmE）进行共转染试验,验证bmo-miR-7对Bmhairy的3′UTR结合位点。【结果】 在家蚕中克隆了Bmhairy,含2个内含子和3个外显子,CDS长654 bp,编码217个氨基酸。Bmhairy的mRNA 3′UTR长366 nt。Bmhairy高度保守,含有bHLH、ORANGE和WRPW结构域。Bmhairy与鳞翅目（Lepidoptera）蛱蝶科（Nymphalidae）中的黑脉金斑蝶（Danaus plexippus）相似度最高。Bmo-miR-7在家蚕胚胎期高量表达,在5龄第3天的精巢中相对较高,而Bmhairy在成虫期的表达量最高,在5龄第3天的头部相对较高。Bmhairy mRNA 3′UTR上有bmo-miR-7一个靶位点。共转染试验表明,bmo-miR-7下调Bmhairy。【结论】Bmhairy的家蚕时期表达和5龄第3天组织表达均与bmo-miR-7的表达呈相反的模式。靶基因预测和双荧光素酶转染试验表明Bmhairy是bmo-miR-7的靶基因,为进一步研究bmo-miR-7和Bmhairy在家蚕体内的生物学功能及调控关系提供了依据。     

雌雄鸡胚性腺microRNA表达检测及靶基因预测分析

动物胚胎发育时期伴随着复杂的基因表达和调控过程,特别是microRNA的基因转录后调控。实验应用二代测序技术测定了发育至6.5d雌雄鸡胚性腺中miRNA表达情况,并对差异表达miRNA进行了靶基因分析。检测分析结果显示,在雄性样品中发现375种miRNA,雌性样品中发现372种miRNA。针对30种在两性性腺中显著差异表达的miRNA,实验采用3个软件(Targetscan 6.0,MirTarget2与miRanda)进行靶基因预测分析,共预测出12 477个靶基因,这些基因显著富集在205个GO分类和11条信号通路中。实验为鸟类性别分化调控机制研究和miRNA靶基因分析提供了基本实验数据和方法学参考。     

miR-15b靶基因预测、信号通路分析及靶基因鉴定

【目的】对miR-15b靶基因进行预测、信号通路分析及鉴定,以期为miR-15b的功能研究奠定基础.【方法】利用Target Scan Release 7.0,PicTar和PITA数据库对miR-15b靶基因进行预测,再用DAVID数据库对预测出的靶基因集进行功能富集分析(gene ontology-analysis)及信号转导通路富集分析(KEGG pathway analysis).随后利用双荧光素酶报告试验对预测出miR-15b的靶基因丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)和CD28进行验证.【结果】3个软件共同预测出miR-15b的靶基因有305个,其靶基因集合功能富集于蛋白激酶活性、GTP结合蛋白调控等分子功能,蛋白氨基酸磷酸化、细胞周期调控等生物学过程及微管相关复合体、转录因子复合体等细胞组分上.信号转导通路则显著富集于癌症相关信号通路.双荧光素酶报告实验结果显示CD28为miR-15b的靶基因,而PDK4不是miR-15b的靶基因.【结论】miR-15b在细胞增殖、凋亡和细胞周期调控等过程中发挥重要调控作用,且miR-15b通过调控CD28的表达对T细胞的受体激活发挥调控作用.     

5种草莓叶片解剖结构与抗旱性的关系

为了筛选出抗旱性优良的草莓种质,以5种野生草莓(东方草莓,黄毛草莓,森林草莓,木犀草莓和五叶草莓)为试验材料,通过测量其叶片解剖结构(角质膜厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、气孔大小、气孔密度、叶片厚度、栅栏组织厚度、栅栏组织层数、海绵组织厚度、海绵组织层数等)指标,计算出栅海比、叶片组织结构紧密度(CTR)、叶片组织结构疏松度(SR)等,以隶属函数法综合分析5种草莓的抗旱性。结果表明:上、下表皮以五叶草莓最厚,分别为27.28μm和18.80μm,而森林草莓最薄(19.59μm和7.29μm);角质膜以黄毛草莓最厚而木犀草莓最薄,分别为7.15μm和3.78μm;叶片和栅栏组织厚度以黄毛草莓最厚,分别为221.21μm和95.86μm,东方草莓最薄(137.12μm和65.51μm);栅海比以五叶草莓最大而木犀草莓最小,分别为1.89%和1.13%;叶片组织结构紧密度(CTR)和疏松度(SR)以东方草莓最大,分别为47.78%和35.96%,五叶草莓最小(34.97%和18.52%);气孔以五叶草莓最大,为45.84μm~2,黄毛草莓最小(30.18μm~2),气孔密度以木犀草莓最大(702.6个·mm~(-2))而黄毛草莓最小(489.9个·mm~(-2))。隶属函数综合评价5种草莓的抗旱性表现为:五叶草莓黄毛草莓东方草莓森林草莓木犀草莓。     

马铃薯microRNA及其靶基因的预测与功能分析

根据miRNA序列在植物中的高度保守性,通过拟南芥、水稻、玉米等植物中已知的miRNA序列与马铃薯的表达序列标签(EST)、基因组测序序列(GSS)以及核酸数据库中的序列进行比对,最后通过在线比对软件blastx去掉编码序列,共发现32条新的miRNAs,并且这32条前体均可折叠形成miRNA家族的标准二级结构;利用新发现的马铃薯miRNAs通过在线软件miRU和miRU2与编码蛋白的数据库比对,预测到了100个靶基因,分别编码与马铃薯生长发育、新陈代谢、信号转导、转录调节、胁迫反应等相关的蛋白.     

草莓叶片不同保存方法对RT-PCR检测 草莓斑驳病毒效果的影响

植物样本保存方法不当易导致样本枯萎和腐烂,严重影响病毒检测结果。为提高PCR法检测草莓斑驳病毒（strawberry mottle virus,SMoV）的效果,明确待检测植物样本的有效保存条件,将经过RT-PCR检测感染SMoV的草莓叶片作为试验材料,设置自然风干保存、硅胶干燥保存和氧化钙（CaO）干燥保存3种不同的干燥保存条件。采用试剂盒法提取各处理草莓叶片总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR检测。比较得到最佳干燥保存条件后,再以几种常见的低温、干燥保存为对照,分析草莓叶片不同保存方法对草莓斑驳病毒PCR检测效果的影响。电泳结果显示,含有SMoV的草莓叶片在CaO干燥保存条件下PCR检测效果最好,且操作简单易行。该方法可以为高效、便捷的保存带毒草莓叶片样本提供参考,适用于田间大量样品的采集,提高检测效率。     

植物microRNA靶基因的预测与验证技术研究进展

MicroRNA(miRNA)是真核生物中具有重要调控功能的一类小分子RNA。植物miRNA通过碱基互补配对方式引导RNA沉默复合体识别靶基因并介导靶基因mRNA被剪切或蛋白质翻译被抑制,所以对植物miRNA靶基因的分析和验证是研究miRNA功能必不可少的一部分。植物miRNA靶基因可通过生物信息学方法预测,主要根据miRNA与mRNA的互补程度进行,然而理论上预测的靶基因尚有待于进一步的试验验证。简要介绍了植物miRNA产生过程的最新研究进展以及靶基因的预测方法,重点综述了植物miRNA靶基因的验证方法,包括RLM-5'RACE、降解组测序、瞬时共表达和转基因系统,为更深入地研究植物miRNA介导的调控机制提供参考。     

草莓KEA家族基因的克隆、鉴定及表达分析

K~+/H~+逆向转运体(KEA)介导细胞中K~+和H~+的动态平衡,在维持植物体内的离子平衡、生长发育和信号转导中起重要作用,然而,相关研究主要体现在模式作物拟南芥中,果树中KEA家族基因的功能依然未知。本研究以Yellow Wonder 5AF8草莓为材料,筛选并克隆KEA家族基因,并对其进行生物信息学鉴定和表达特征分析,为研究果树K~+/H~+平衡及钾素动态平衡机制提供基因资源和理论依据。结果表明,在草莓基因组中检索并克隆到5个KEA家族基因,命名为FveKEA1～FveKEA5,属于典型的植物K~+/H~+逆向转运体基因;编码的蛋白质与7种已报道的不同科属植物的KEA家族蛋白在氨基酸水平上具有25.00%的一致性,并可分为2个亚族(Group I和Group II),其中,草莓FveKEA1和FveKEA2属于Group I,只含有4个Motif基序,而FveKEA3～FveKEA5属于Group II,含有7个Motif基序;系统进化树表明草莓FveKEA2和FveKEA4分别与葡萄VvKEA2和苹果MdoKEA6紧密聚在一起,草莓FveKEA1、FveKEA3和FveKEA5分别与葡萄VvKEA1、白杨PtrKEA4、桃PpeKEA4等相应成员在遗传距离上较近;草莓KEA家族蛋白主要定位于细胞质膜,均含有12～14个跨膜区,除FveKEA3外,均为稳定蛋白,且只有FveKEA5含有信号肽;转录表达谱分析结果揭示草莓KEA家族基因在多种组织或器官中均有表达,实时荧光定量PCR结果表明FveKEA1在5AF8草莓不同组织中的整体表达水平最高,在花瓣和未成熟果实中的表达量最为突出,其次是FveKEA4,而其他3个基因的整体表达水平相对较低。此外,在草莓KEA基因启动子区域鉴定到至少16种顺式作用元件,且均含有光感应、胚乳表达和脱落酸(ABA)响应的作用元件。     

水稻叶片淀粉累积早衰突变体pls5的鉴定及基因定位

[目的]本研究旨在对水稻叶片淀粉累积早衰突变体pls5进行表型分析及基因定位,探讨水稻叶片早衰的分子机制。[方法]对pls5突变体进行田间农艺性状调查和光合速率测定;于抽穗期对倒2叶(无明显早衰表型)、倒3叶(出现早衰)和倒4叶(严重早衰表型)进行色素和活性氧含量测定,观察叶绿体超微结构;利用Real-time PCR对淀粉代谢和衰老相关基因进行表达分析,以及候选基因的图位克隆与测序。[结果]pls5突变体早期大田生长正常,早衰表型始于分蘖后期,至乳熟期所有叶片衰老。与野生型相比,pls5突变体色素含量和净光合速率极显著降低,同时每穗总粒数、结实率和千粒质量显著下降。倒3叶叶绿体中积累大量的淀粉粒,类囊体片层由于淀粉粒的大量积累被挤压到细胞膜周围;倒4叶叶绿体中积累大量嗜锇体,类囊体片层解体。同时,pls5中淀粉代谢和衰老相关基因的表达显著上调,活性氧积累。遗传分析表明,pls5的突变表型是由隐性单基因突变引起的;利用图位克隆将目标基因定位在第5染色体的长臂标记P7和P4之间,物理距离154 kb,共18个ORF;对区间内已报道基因ES5(Os05g0554400)测序,发现在第11个外显子存在437 bp的插入,导致移码突变翻译提前终止,推测其为候选基因。[结论]pls5是早衰突变体es5的等位变异,在衰老叶片中存在淀粉累积,这些有利于进一步理解叶片早衰的内在机制。     

基于基因组的绒毛状烟草和林烟草microRNA及其靶基因分析

【目的】填补绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis）和林烟草（Nicotiana sylvestris）在miRNA相关领域的研究空白,揭示普通烟草（Nicotiana tabacum）的生长发育调控机理。【方法】在绒毛状烟草和林烟草全基因组中预测并分析miRNA及其靶基因,通过同源比对及miRNA前体二级结构特征进行预测：参考序列在绒毛状烟草和林烟草基因组的比对中,允许最多1-2个错配;miRNA二级结构为经典茎环结构,其中MEF最大值为-25,MEFI最小值为0.85,预测的miRNA与已知的同一家族的miRNA位于发夹结构的同一条臂上;去除E值小于等于1e-6的编码蛋白的序列。【结果】在绒毛状烟草中得到39个家族的162条miRNA,包括14对正/反义miRNA和5个基因簇。在林烟草中得到40个家族的169条miRNA,包括13对正/反义miRNA和3个基因簇。2个野生烟草在保守度高的miRNA家族中,其成员分布相似,且成员数相近。在保守度相对较低的家族中,2个野生烟草其成员分布差异较为明显,其中,miR5021、miR5203等9个家族仅在绒毛状烟草中有成员,miR1446、miR1509等10个家族仅在林烟草中有成员。2种野生烟草的正义miRNA与反义miRNA都有着1-4个碱基差异,这些差异位点在不同的家族中呈现出偏好性,而且在2种野生烟草中偏好性相似：miR164家族的9、12、13个碱基处,miR172家族的1、21个碱基处,miR396家族的2、17个碱基处,miR399家族的15、20个碱基处。2种野生烟草的基因簇主要是由miR156、miR169家族组成,其前体的间距小于350 nt,同时在绒毛状烟草中首次发现miR6019/miR6020基因簇。以普通烟草的unigene数据库作为靶基因集进行预测与分析,在绒毛状烟草122条miRNA中得到749个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因206条,其中89条（43%）得到GO功能注释;在林烟草中117条miRNA得到650个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因169条,其中78条（46%）得到GO功能注释。在分子功能方面,大多数靶基因具有结合等活性。在生物学过程中,靶基因主要参与了发育过程、生殖过程、多细胞器官发育过程、胁迫应答过程等。【结论】控制发育和多细胞器官发育过程的靶基因数方面以林烟草居多,而胁迫应答的靶基因数以绒毛状烟草较多。     

沙田柚PIF5基因的鉴定及序列分析

对沙田柚的PIF5转录因子基因进行鉴定和序列分析。生物信息学分析结果表明,该基因全长2 323 bp(Gen Bank登录号:MH020222),含有1 512 bp的开放阅读框(ORF),共编码503个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为54.95 kDa,等电点PI为5.12。该蛋白质含有一个PP2Cc保守结构域,为亲水性稳定蛋白。氨基酸序列分析表明,该氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)和甜橙(Citrus sinensis)相似性很高,相似度分别达到100%和99%。系统进化分析发现沙田柚的PIF5转录因子基因与克莱门柚和甜橙亲缘关系很近,属于同一分支。转录组测序结果表明:PIF5基因在沙田柚在未授粉花柱中的表达量(RPKM)为2.94,自花授粉1、2、3 d花柱中的表达量(RPKM)分别为4.35、3.74、3.99,在异花授粉1、2、3 d花柱中基因的表达量(RPKM)则分别为3.39、1.70和0.98。     

森林草莓bHLH家族基因的鉴定与分析

bHLH转录因子在植物的生长发育、生物合成及胁迫反应等方面起着重要作用.利用生物信息学方法对森林草莓全基因组序列进行bHLH家族的搜索和鉴定,共鉴定出112个森林草莓的bHLH基因,这些基因分别被定位在7条染色体上,但分布不均匀,在5号染色体上分布得最多,3号染色体上分布得最少.进化树结果显示,森林草莓的bHLH家族可...     

枣树novel-miR16靶基因ZjTCP4鉴定及生物信息学分析

TCPs转录因子主要通过调节细胞增殖和植物激素途径来调控植物器官发生和形态构型,探究枣树ZjTCP4转录因子的序列特征及其表达特性,以期为TCP转录因子响应干旱胁迫的机理研究提供参考,也可以为后续对枣树分子育种奠定基础。novel-miR16的二级结构具有miRNA典型的发夹结构,为枣树miR319家族成员;靶基因ZjTCP4的降解位点多数都在novel-miR16结合位点的第10和11个核苷酸的位置;生物信息学分析表明,ZjTCP4基因的全长cDNA序列为1 386 bp,预测编码452个氨基酸的多肽,预测编码蛋白的等电点(pI)为6.51,分子量为49 091.55 u;应该是一个膜内或膜外蛋白,为非分泌性蛋白,为亲水性蛋白质,定位于细胞核;枣树ZjTCP4基因编码的氨基酸序列与拟南芥AtTCP4最为相似,与拟南芥AtTCP17,AtTCP18和AtTCP12的相似性也较高;枣树novel-miR16在响应干旱胁迫的过程中上调表达,而其靶基因ZjTCP4在干旱胁迫下下调表达。枣树novel-miR16通过靶向调控ZjTCP4转录因子响应干旱胁迫,干旱胁迫下枣树novel-miR16...     

三种草莓病毒的多重RT-PCR检测方法

目前,草莓主要有3种病毒侵染,本研究通过改进CTAB法对经过茎尖剥离的组培四季草莓叶片提取总核酸,采用多重RT-PCR技术同时检测草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒和草莓镶脉病毒。电泳结果显示提取的总核酸中可见总DNA条带和完整的RNA条带,并采用两步法RT-PCR获得了目的条带。本研究建立了多重RT-PCR同时检测草莓病毒的技术体系。     

森林草莓HD-ZipⅠ亚家族基因的鉴定及表达分析

[目的]本文旨在鉴定森林草莓同源异型域-亮氨酸拉链家族(homeodomain-leucine Zipper,HD-Zip)Ⅰ亚家族的转录因子,分析其序列属性及表达模式,为其进一步功能研究和利用奠定基础。[方法]运用生物信息学方法,鉴定和分析森林草莓HD-ZipⅠ亚家族基因的系统进化关系、蛋白基序、基因结构、复制方式及启动子元件等;利用公共转录组数据和荧光定量PCR技术,分析其在花和早期果实中以及黑暗、脱落酸(ABA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)或水杨酸(SA)处理的离体叶片中的表达模式。[结果]森林草莓HD-ZipⅠ亚家族包含11个基因,它们含有0～3个内含子,相对均匀地分布在第1和3～7号染色体上。全基因组/片段复制是HD-ZipⅠ亚家族基因扩张的主要复制方式。光和激素响应元件是其启动子区所占比例最高的2类顺式作用元件。转录组数据显示,多数HD-ZipⅠ基因在森林草莓除成熟花粉粒和胚之外的花和早期果实组织中表达量较高。5个HD-ZipⅠ亚家族基因的定量结果表明,FvH4_1g20230、FvH4_5g36570、FvH4_5g15520和FvH4_7g32570基因在ABA、6-BA或SA处理3和6 h时有响应;FvH4_7g32570基因在黑暗时被诱导,FvH4_5g36570、FvH4_7g32570、FvH4_1g20230、FvH4_5g15520基因在ABA诱导的离体叶片衰老过程中发生显著的表达变化;而在6-BA处理的叶片中,这5个基因的表达与对照相比均无持续的显著变化。[结论]HD-ZipⅠ亚家族基因很可能在黑暗和ABA诱导的森林草莓离体叶片衰老过程中起重要的调控作用,并参与森林草莓花和早期果实的发育以及激素响应过程。     

叶片保存方法对RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒的影响

【目的】探究通过RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒最好的叶片保存方法。【方法】经自然风干法、硅胶干燥法以及氧化钙干燥法保存后,采用RNA小量提取试剂盒法提取被病毒侵染草莓叶片总RNA,利用Thermo NanoDrop 2000测定核酸质量浓度和质量并使用RT-PCR方法对SMYEV进行检测。【结果】经氧化钙干燥保存后可提取高质量的RNA,30 d后仍可通过RT-PCR获得扩增产物。【结论】氧化钙干燥保存效果最好,操作简单,成本低,可广泛应用于大量草莓叶片样本的长距离运输,提高草莓病毒检测效率,为草莓无毒栽培提供保障。