鸡传染性支气管炎诊断方法研究进展

一、血清学诊断方法 国际动物卫生组织（OIE）指定的IBV诊断方法包括：病毒分离鉴定、鸡胚中和试验、琼脂免疫扩散试验、HI和常规ELISA。鸡胚中和试验，费时较长，操作复杂；琼脂免疫扩散试验敏感性较低；因IBV不能直接凝集红细胞，经处理的抗原制备的川诊断液检测结果不稳定；     

一种快速简便的传染性支气管炎病毒的诊断方法

目前国内用于传染性支气管炎病毒（IBV）的血清学诊断方法有琼脂扩散试验（AGP）、间接血凝试验（IRHA）[1]、酶联免疫吸附试验（ELISA）[2]、以及用鸡胚、气管环、肾细胞的血清中和试验（SN）[3-5]。AGP虽然操作比较简单，但用于免疫检测却不理想，因为疫苗免疫后血清中沉淀抗     

鸡传染性支气管炎病毒上海株的分离与鉴定

本研究对分离自上海某养鸡场的疑似鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)进行了分离和鉴定.所采用的方法有:鸡胚致病性试验、对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的干扰试验、动物回归试验以及RT-PCR鉴定等.试验结果表明,该病原接种鸡胚后,48 h可引起鸡胚死亡,胚体呈侏儒样变化,对NDV感染有明显干扰作用;用分离的病毒接种SPF雏鸡可产生明显呼吸道症状,肾脏表现肿大和大量尿酸盐沉积等病理变化;用IBV特异性引物可以从分离物中扩增出IBV的N基因序列,测序结果表明,该毒株属于肾型IBV.综上所述,本研究在上海流行区域成功分离到一株IBV,将其命名为SH11株.     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离与初步鉴定

从死亡率达30％的鸡传染性支气管炎（BI）发病鸡群中分离到一株IB病毒（IBV），命名为NB90株，该株可使鸡于接种后48小时80％发病，20％死亡，鸡胚接种试验和电镜形态学观测证明该分离物为IBV。血清中和试验表明，与国外肾型IBV标准株（美国的G株和澳大利亚的T株）抗原性相同；与IBV标准株M41抗原性不同。初步鉴定分离株NB90是肾型IBV株。     

鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定

采用自然感染鸡的气管粘膜及分泌物为材料，以鸡胚接种分离出一株病毒ＣＬ９４。通过接种鸡胚的病变特点、回归本动物试验、琼脂免疫扩散试验、毒价测定、中和试验以及对有机溶剂的敏感试验等证明ＣＬ９４分离株是鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）。为证实ＩＬＴ在安徽存在提供了可靠的依据。     

鸡传染性喉气管炎病毒的分离与鉴定

本试验采用自然感染患鸡的气管粘膜及分泌物为材料，以鸡胚接种分离出一株病毒ＣＬ９４．通过接种鸡胚的病变特点、回归本动物试验、琼脂免疫扩散试验、毒价测定、中和试验以及有机溶剂的敏感试验等证明ＣＬ９４株分离毒是鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）．为证实ＩＬＴＶ在安徽存在提供了可靠的依据。     

传染性支气管炎病毒的鉴定

试验采用鸡胚接种和气管环培养相结合的方法,对IBV毒株进行培养鉴定,IBV经鸡胚传一代后再上鸡胚气管环培养可引起气管环纤毛运动停止,应用此法可以快速地进行IBV检测。     

抗传染性支气管炎病毒中药的研究

用细胞培养法、鸡胚培养法对车前子、麦冬等40种中药进行抗传染性支气管炎病毒（IBV）的筛选试验。通过细胞病变（CPE）抑制试验，石榴皮等5种中药有抑制CPE的作用。培养细胞有20%发生CPE，认为这些中药有抗IBV的作用。应用空斑形成抑制试验对5种抗IBV中药进行复筛，结果表明5种中药均有不同程度的抑制病毒空斑形成作用，其中以石榴皮等2种中药作用较强，空斑形成抑制率可达98%以上。应用鸡胚培养法对5种中药进行抗IBV试验，结果发现5种中药均显著地减少了鸡胚体的死亡，其中以石榴皮等2种中药抑制制胚体病变的作用最强。通过不同加药时间观察到在接毒前48h给药，有2种中药具有明显抑制CPE的作用；接毒同时加药以及接毒后1h加药，这5种中药均能明显抑制CPE。     

中药金丝桃素鸡胚接种抗鸭病毒性肝炎的试验研究

采用鸡胚培养法和琼脂扩散试验，测定了中药金丝桃素口服液对鸭肝炎病毒的抑制作用。结果表明，中药金丝桃素口服液对鸡胚毒副作用较小，在药物与病毒同时接种情况下，能抑制鸭肝炎病毒在鸡胚中的增殖。     

鸡传染性支气管炎病毒的快速检测

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性PCR方法。通过对纯化后IBV核蛋白基因进行的直接PCR及套式PCR扩增表明，两次PCR产物的大小为0.7kb和0.5kb，与实际设计相符。而对照的NDV主IBDV的PCR扩增产物均为阴性。用IBV HB（华北）株感染SPF鸡后，应用我们所建立的PCR方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的IBV，在SPF鸡感染IBV后的21天仍然能够检测到IBV的基因组，Southern blot杂交试验证明了我们获得的PCR产物为IBV的核蛋白基因。对30份自然感染病料的检测表明，本实验所建立的PCR方法检测阳性数为15份，阳性率为50％（15／30）；鸡胚接种检测的阳性数为17份，阳性率为56．7％（17／30）；IFA检测的阳性数11 ，阳性率为36．7％（11／30）。PVR检测法与鸡胚接种方法的阳性符合率为93．3％（14／15），统计学分析表明，P＞0．05，差异不显著，而PCR检测法与IFA的阳性符合率为60％（9／15）。结果证明本实验所建立的PCR检测方法具有敏感、特异、快速等特点，适用于不同来源及不同血清型IBV的检测。     

鸡传染性喉气管炎免疫扩散试验研究

鸡传染性喉气管炎免疫扩散试验的最佳条件是：用ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）或鸡胚肾细胞（ＣＥＫ）制备抗原，用８％ＮａＣｌ的ＰＢＳ（ｐＨ７．２）配制１％的琼脂糖，孔径、孔距均为３ｍｍ。     

鸡新城疫病毒与传染性支气管炎病毒同胚培养的试验研究

将鸡新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）按一定的稀释比例等量混合接种9~10日龄SPF鸡胚,让其在同一鸡胚中增殖（简称同胚培养）。试验结果表明,用5倍稀释的ND-Lasota病毒液与 5000倍稀释的IBH₁₂₀病毒液等体积混合后尿囊腔接种鸡胚,能在同一鸡胚中正常增殖,接种后96 h收毒,用红细胞凝集试验（HA）测得NDV、IBV两种病毒的血凝价分别为11 log2和12 log2,不低于各自病毒单独增殖的HA滴度,病毒的增殖基本趋于平衡。同时也证实了在合适的培养条件下,IBV对NDV的复制不会产生干扰。     

鸡新城疫La Sota株、鸡传染性支气管炎W93株二联活疫苗研究Ⅱ.接毒剂量选择试验

将鸡新城疫La Sota毒种和嗜肾型鸡传染性支气管炎W93毒种分别用生理盐水做适当稀释后，将两种病毒液等量混合，接种于同一SPF鸡胚尿囊腔内。结果表明，HBV、NDV在同一鸡胚内增殖时无互相干扰现象；收获的鸡胚液(La Sota W93)中NDV、IBV的效价分别达到相应单苗水平。     

通过鸡新城疫La Sota株的干扰作用鉴定传染性支气管炎病毒

传染性支气管炎病毒(IBV)干扰鸡新城疫病毒(NDV)在鸡胚上的生长现象已被作为一种诊断传染性支气管炎的方法。用IBV—NDV干扰试验对十五株来自疑为传染性支气管炎鸡群的病毒进行分析:接种IBV10小时后再接种NDV La Sota毒株,后通过血凝(HA)试验测定,有八株能干扰La Sota在鸡胚上的生长。 IBV这种干扰作用具有特异性,因为它可被相应的IBV抗血清所抑制。此种方法证明干扰作用是敏感的。在一些IBV继代代数少的情况下、虽然IBV不引起鸡胚产生病变,但可干扰NDV的HA活性。此外,血清学反应IBV阴性的样品不能干扰NDV在鸡胚上的生长。从以上情况看,对于分离IBV野毒来说,IBV—NDV干扰试验显然是一种改进的诊断方法。     

鸡肾型传染性支气管炎(HK株)活疫苗生产条件的探讨

采取不同浓度的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)接种不同日龄的鸡胚,在不同时间内收获鸡胚液。根据收获时鸡胚的死亡情况、胚液的收获量及胚液的病毒含量,优选IBV活疫苗生产的最佳条件。结果表明,将IBV调整为102.0~103.0EID50/0.1ml,尿囊内接种于12日龄鸡胚中,每胚0.1ml,37℃孵育33h收获,胚液的产毒量和收获量最高。     

鸡传染性支气管炎病毒广西分离株血清型的分析

应用病毒感染的鸡胚材料免疫新西兰兔的方法制备抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单因子血清,然后在鸡胚气管环培养(Tracheal organ cultures,TOC)上对广西分离的7个IBV代表性毒株和3个常用疫苗株进行交叉病毒中和试验。结果显示,10个毒株被分为6个血清型。根据试验所得的R值,应用聚类分析法分析了各血清型毒株之间的亲缘关系,显示目前在广西流行的IBV野毒株之间以及其与疫苗株间的抗原性存在很大程度的差异,分属不同的血清型。同时还对IBV基因分型和血清分型之间的关系进行了探讨。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

禽脑脊髓炎病毒琼扩抗原的制备及其在评价鸡群抗体水平中的应用

以标准的禽脑脊髓炎病毒ＶＲ毒株和分离的野毒株分别感染ＳＰＦ鸡胚，取其病料组织制成琼脂扩散抗原。在含２０％ＮａＣｌ和０．５％苯酚的０．８％琼脂凝胶中，用这种抗原以琼脂扩散试验检测ＡＥ抗体，结果稳定，特异性强，方法简使迅速。     

不同病毒在SPF鸡胚与普通鸡胚繁殖性能的比较

利用HI和AGP方法检测普通种蛋中ND和IBD的卵黄抗体水平，利用HA和EID50检测方法比较多种病毒(如NDV、IBV、IBDV及AEV)在SPF鸡胚与普通鸡胚上繁殖性能的差异。研究结果表明：普通种蛋中ND及IBD的卵黄抗体水平普遍较高，在SPF鸡胚上新城疫La Sota病毒繁殖量是普通鸡胚的5～20倍，尿囊液血凝效价平均高2.0～2.5滴度。MA5毒株在SPF胚病毒液EID50为普通鸡胚的10倍以上，且每次检测的结果比较接近。IBDV、AEV等病毒在普通鸡胚上几乎不能增殖。     

感染鸡胚的鸭肝炎病毒适应毒株的筛选试验

自Levine等（1950）首次于鸡胚中分离到鸭肝炎病毒（DHV）以来．在感染鸡胚上进行的血清中和试验在鸭病毒性肝炎的诊断上得到了广泛应用，并被公认为权威的诊断方法，虽然近几年发展而成的琼扩、间接血凝、ELISA等方法逐渐取代了繁琐、费时的中和试验，但由于DHV细胞培养上的难度，鸡旺接种在DHV的增殖等方面仍有切实的应用价值。为了更有效地便于实验观察及收获病毒，我们对DHV的鸡胚适应毒株进行了筛选、比较，以寻找最适鸡胚毒株。1材料与方法1．1材料111试验用毒林：QI弱毒株、ATCC（Cg／DZ）标准毒株、E52。疫苗毒株，由南…