兔支气管败血波氏杆菌OMP-ELISA抗体检测方法的建立

为简便快速检测支气管败血波氏杆菌(Bb),建立了一种特异、敏感的间接ELISA方法。通过应用超声波裂解和超速离心法提取了支气管败血波氏杆菌Ⅰ相菌外膜蛋白(OMPs),并用该蛋白包被酶标板,经特异性、敏感性和重复性试验优化后建立间接ELISA方法。结果表明,试验确定抗原的包被浓度为14.44μg/ml,可检测血清最高稀释度达1：400;该方法有很高的特异性和敏感性,与微量凝集试验相比,敏感性提高约33倍;该方法重复性良好。     

支气管败血波氏杆菌的间接ELISA诊断方法

我国随着集约化猪场的迅速发展，国外引种及国内种猪的频繁调动，使得猪萎缩性鼻炎在许多猪场发生。在萎缩性鼻炎症状的猪鼻腔分泌物中，61．5％的分离菌为支气管败血波氏杆菌，说明该菌是导致本病的主要病原菌（宋克磊），因此支气管败血波氏杆菌的防制和检测方法的研究显得尤为重要。间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA试验）是一种快速、准确、简便的方法，并具有敏感性高、特异性强的特点，且能够同时检验大量血清样品（陈博文），因此间接ELISA方法是检测波氏杆菌抗体的一种优良方法。     

兔支气管败血波氏杆菌不同感染途径研究

用兔支气管败血波氏杆菌分离株BJL0504菌株(I相菌)经滴鼻、肺内、气管、静脉、皮下对30～40日龄兔攻毒,并进行临床观察和微生物学检查,比较不同攻毒方法的优势。结果显示,经静脉注射的家兔发病率和死亡率高,症状较典型;经肺内注射也可以引起部分发病和死亡;滴鼻和气管注射感染均可以复制到典型的临床症状,但是解剖病变都不明显。由此可见,支气管败血波氏杆菌经静脉攻毒可以较好的复制病例,这对支气管败血波氏杆菌的致病机理的研究、疫苗的研制和评价提供了理论基础。     

支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立和应用

根据支气管败血波氏杆菌ptxA基因设计1对引物,扩增特异的872 bp核酸片段,建立了应用PCR检测支气管败血波氏杆菌的方法.特异性试验结果表明,3株支气管败血波氏杆菌参考菌株均能扩增出872 bp特异性的核酸片段,兔源性的大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为210个支气管败血波氏杆菌.利用建立的PCR检测方法对22株从山东省泰安地区某兔场采集的疑似兔支气管败血波氏杆菌病病兔鼻黏液棉拭子进行检测,结果19株为阳性.并同时进行普通血清学方法和细菌学方法,对检测结果进行了比较,结果显示,PCR方法阳性检出率高于其他检测方法.     

禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒（AIV）抗原的双抗体夹心ELISA方法。经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件：兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1：8000（浓度为3.531μg/ml）,抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1：800,酶标二抗的工作浓度为1：4000。与其他禽易感病毒（NDV、IBV、EDS-76V）等均没有交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可应用于AIV的检测和流行病学调查。     

兔支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

对陕西商洛某养殖场病死兔解剖、无菌采取病料,从病料中分离到1株革兰阴性小杆菌,经生物学特性试验和生理生化试验鉴定,为兔支气管败血波氏杆菌.药敏试验结果表明,该分离菌株对环丙沙星、氟哌酸、氧氟沙星等抗生素高度敏感;对氯霉素、红霉素、四环素等抗生素耐药.外毒素试验和动物致病性试验对小白鼠均有致病作用.     

犬瘟热病毒单抗夹心ELISA检测方法的建立

以2株犬瘟热病毒(CDV)特异性单克隆抗体2H11和1G7为基础建立了检测CDV的单抗夹心ELISA方法.用单抗2H11作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的单抗1G7为检测抗体,通过方阵试验确定2H11和1G7-HRP的最佳工作浓度分别为200和475 ng· mL-1.建立的单抗夹心ELISA方法具有良好的...     

PCR检测兔支气管败血波氏杆菌方法的建立及应用

为建立准确、快速检测兔支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)的PCR方法,根据Gen Bank中波氏杆菌ptxA基因设计1对特异性引物,用建立的PCR方法扩增兔波氏杆菌,可扩增出870 bp的目的片段。该方法特异性好,仅对波氏杆菌有特异性的扩增,而对大肠埃希菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌等病原菌的扩增结果呈阴性;敏感性较高,最低检测限可达6.8×10~(-7)μg/m L;用建立的PCR方法检测临床疑似感染支气管败血波氏杆菌病兔的脏器及鼻拭子样品,可扩增出目的条带,且与细菌分离的结果一致。可见,建立的检测方法敏感、特异,可用于临床上兔波氏杆菌病的快速诊断及鉴定。     

兔支气管败血波氏杆菌菌毛粗提物3种抗体检测方法的建立及比较

利用超声波处理结合TritonX-100溶解法制备粗提的菌毛抗原,建立了3种用于支气管败血波氏杆菌的抗体检测方法:琼脂免疫扩散试验(AGID)、玻片凝集试验(SAT)、间接血凝试验(IHA)。临床检测了458份兔血清样品,结果显示:HA试验的阳性检出率最高,为73.36%(336/458),AGID试验阳性63.54%(291/458),SAT试验阳性61.79%(283/458),三者平均阳性为57.20%(262/458);IHA与AGID的符合率为90.17%,IHA与SAT的符合率为86.68%,AGID与SAT的符合率为89.08%。表明IHA试验更为敏感,可用于支气管败血波氏杆菌的血清学监测。     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用特异性好的鼠源抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体为捕获抗体,兔源多克隆抗体为检测抗体,建立PEDV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳反应条件为:抗PEDV单克隆抗体E1包被质量浓度4.40μg·mL~(-1),37℃包被2h,采用5%BSA封闭液封闭1h,兔抗PEDV抗体工作质量浓度为5.91μg·mL~(-1),酶标二抗稀释度为1∶2000,以OD450nm≥0.381作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。敏感度可达30μg·mL~(-1)(5×103.12);重复性变异系数小于10%。采用该方法和RT-PCR方法同时检测临床样品42份,阳性样品符合率为92.30%,表明建立的PEDV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高和方便快捷等优点,可用于PEDV快速检测。     

双抗体夹心ELISA法检测海产蟹血卵涡鞭虫方法的初步建立

以针对血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体为捕获抗体,纯化的抗血卵涡鞭虫的兔抗血清为检测抗体,初步建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定确定最佳反应条件：包被的单克隆抗体浓度为10μg/mL,多抗兔血清工作浓度为14.3μg/mL,待检样品稀释度为1：800;HRP-羊抗鼠IgG按1∶20 000稀释。用建立的ELISA方法对86份已知背景样品进行检测,阳性检出为97.6%,血卵涡鞭虫抗原检测的灵敏度为100 pg/mL;与蟹血淋巴细胞、假丝酵母菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等样本均无交叉反应。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于诊断梭子蟹乳化病血卵涡鞭虫病的检测。     

猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

 【目的】探讨2003～2006年间支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）在中国湖北等十余省市猪群中的流行病学分布和协同感染特性并对部分菌株进行生物学特性研究。【方法】采用病原菌的形态学观察、生化鉴定和PCR鉴定,从2 057份有肺炎或萎缩性鼻炎症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的其它共感染菌。经生化鉴定,药敏试验、血凝试验及动物试验等方法进行检测和分析。【结果】在中国湖北等十余省市的猪群中,不同省份Bb的总分离率介于7.3%～14.1%之间;不同年份Bb的总分离率介于7.3%～11.8%之间;2003～2006年间的Bb总分离率为9.2%;Bb的分离率与猪日龄有一定的关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌（55.9%）、副猪嗜血杆菌（50.0%）、大肠杆菌（43.1%）、巴氏杆菌（25.5%）、绿脓杆菌（17.6%）和沙门氏菌（11.8%）。在43份有典型萎缩性鼻炎症状猪的病料中,分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌;在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出了Bb,而其中6份又同时分离出了绿脓杆菌。对2003年分离的31株Bb进行药敏试验、红细胞凝集试验和乳鼠皮肤坏死试验。结果表明：各菌株对15种药物的耐药谱不同,但对卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素B、环丙沙星和舒普深高度敏感;各菌株均可凝集猪和羊的红细胞且能不同程度导致乳鼠皮肤坏死。【结论】在中国湖北等十余省市的猪群中,Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重,且在萎缩性鼻炎的病猪中检出率最高。     

兔支气管败血性波氏杆菌fimN基因的原核表达

应用PCR方法扩增兔支气管波氏杆菌(Bb)的菌毛蛋白基因( fimN),将fimN基因克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET28a-fimN。将此重组质粒转化受体菌BL21后,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达蛋白分子量大小约为27 kD,与理论预期值相符。用Western-blot试验分析纯化的表达产物,结果表明,该重组蛋白能与Bb阳性血清发生特异性反应。     

牛轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的牛轮状病毒(BRV)分别免疫鼠和兔,制备了鼠抗BRV和兔抗BRV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测BRV的双抗体夹心ELISA方法.该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:兔抗BRV IgG包被浓度为10μg·mL-1,鼠抗BRV IgG工作浓度为5 μg·mL-1,样品反应时间60 mi...     

兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌复合PCR方法的建立及临床应用

根据Gen Bank中多杀性巴氏杆菌ATP合成酶基因(atp B)的保守序列设计特异性引物,建立巴氏杆菌PCR检测方法,并与已建立的支气管败血波氏杆菌PCR检测方法进行合并,经反应条件的优化,成功建立多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌复合PCR诊断方法。该方法检出的最小多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌菌数分别为40 CFU和4 CFU;对兔源产气荚膜梭菌、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪鼻支原体、链球菌的检测结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。用该方法对中国4个省份采集的临床鼻拭子样本共712份进行检测,结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为25.56%,支气管败血波氏杆菌阳性率为34.55%,双阳性率为13.20%。该复合PCR方法能快速、敏感地从家兔鼻拭子样品中检出多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌,为临床疾病检测和流行病学调查提供了技术保障。     

广西猪支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

为掌握广西猪传染性萎缩性鼻炎（AR）发病情况、猪支气管败血波氏杆菌（Bb）流行血清型及耐药情况,分别从广西南宁、上林、贵港、武鸣等地4个规模化猪场和1个屠宰场采集到247份猪鼻腔分泌物样品,径常规细菌分离获得57株Bb可疑菌株,以生理生化试验和PCR鉴定等方法对可疑菌株进行鉴定,并根据O、K抗血清凝集试验进行分型.结果表明,57株可疑菌株均确定为Bb,其中6株为Ⅰ相Bb、14株为Ⅱ相Bb、37株为m相Bb,且Ⅰ相Bb毒力较Ⅱ相、Ⅲ相Bb毒力强;药敏试验结果表明,大多数Bb对复方新诺明、阿米卡星、新霉素、庆大霉素和环丙沙星等高度敏感,对阿莫西林、青霉素、痢特灵、氨苄青霉素、呋喃妥因、头孢氨苄、林可霉素、头孢噻吩、恩诺沙星、万古霉素和利福平等不敏感.     

Immunoproteomic Analysis of Bordetella bronchiseptica Outer Membrane Proteins and Identification of New Immunogenic Proteins

Bordetella bronchiseptica is a Gram-negative pathogen that causes acute and chronic respiratory infection in a variety of animals. To identify useful antigen candidates for diagnosis and subunit vaccine of B. bronchiseptica, immunoproteomic analysis was adopted to analyse outer membrane proteins of it. The outer membrane proteins extracted from B. bronchiseptica were separated by two-dimensional gel electrophoresis and analyzed by Western blotting for their reactivity with the convalescent serum against two strains. Immunogenic proteins were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight-mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）, a total of 14 proteins are common immunoreactive proteins, of which 1 was known antigen and 13 were novel immunogenic proteins for B. bronchiseptica. Putative lipoprotein gene was cloned and recombinantly expressed. The recombinant protein induced high titer antibody, but showed low protective indices against challenges with HB（B. bronchiseptica strain isolated from a infected rabbit）. The mortality of mice was 80% compared to 100% of positive controls. The identification of these novel antigenic proteins is an important resource for further development of a new diagnostic test and vaccine for B. bronchiseptica.     

支气管败血波氏杆菌dnt基因的克隆、表达及活性鉴定

通过PCR扩增获得支气管败血波氏杆菌的全长4 395 bpdnt基因,并利用pET-28a/BL21系统对其进行了融合表达。Western-blot检测结果表明,表达产物具有良好的免疫学活性。使用His-band purification kit纯化后,得到纯度为93.2%的融合蛋白HIS6-DNT。在乳鼠皮肤坏死试验中,表达产物HIS6-DNT和天然DNT均能导致乳鼠皮肤产生坏死性病变。在乳鼠皮肤坏死阻断试验中,兔抗HIS6-DNT血清能中和天然DNT,使其失去对乳鼠皮肤的坏死毒性。试验结果表明,重组蛋白具有天然DNT的生物学毒性和免疫原性,所产生的抗体具有中和活性,为DNT的结构和功能研究奠定了基础。