新城疫病毒山东强毒株的分离鉴定

从山东流行烈性传染病的鸡群中分离出7株具有血凝活性的病毒，该7株病毒的血凝活性均能被新城疫La Sota株标准阳性血清所抑制，但病毒不能被中和，仍能致死鸡胚。经分离鉴定，分离毒均为新成疫病毒株。通过鸡胚半致死量（ELD50）、最小致死量致鸡胚的平均时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内致死指数（ICPI）、6周龄雏鸡静脉致死指数（IVPI）、血凝解脱及血凝素稳定性等试验表明：7株分离病毒均为新城疫病毒强毒性，其毒力与标准强毒株F48E9株相似。     

新城疫病毒HeB02分离株F基因的序列分析

根据国外已发表的新城疫病毒F基因序列，设计了1对引物，并以RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒HeB02分离株的F基因，基因产物大小为1．63kb，与设计相符。对其进行序列测定后，与其他标准毒株F48E9、LaSota和Clone30的F基因进行了同源性比较，结果表明，HeB02株与国内标准强毒株F48E9及目前广泛应用的弱毒疫苗株LaSota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88.1％、84.9％和83.8％。由此可以看出，HeB02分离株与标准毒株和疫苗株相比，在F基因上发生了变导。     

RT-PCR对新城疫病毒强弱毒株的快速鉴定

根据新城疫病毒(NDV)F蛋白基因结构的特点及强、弱毒株F蛋白基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,并将其配成3对引物,采用RT-PCR试验对来自鸡和七彩山鸡的9株NDV野毒分离株,F48E8和LaSota 2株标准强、弱毒株进行了快速鉴定;并将RT-PCR鉴定结果与NDV常规致病性试验结果进行了比较。结果表明,RT-PCR试验能够快速将11个参试毒株区分为强毒株和弱毒株,其结果与传统致病性试验测定结果基本一致,该方法可以用于ND的快速诊断和强、弱毒株的快速鉴定。     

3个不同基因型新城疫病毒间的抗原同源性比较

分别以鸡新城疫病毒（NDV）基因Ⅱ型弱毒疫苗株LaSota、基因Ⅶ型鸡源野毒株Y98F9和基因Ⅵ型鸽源野毒株PB9601为灭活疫苗，制备相应的抗血清。将3株病毒分别与相应的抗血清做交叉血凝抑制试验（HI）和在细胞培养上做交叉病毒中和试验（VI）．以此比较3个基因型病毒间的抗原同源性关系。在交叉HI中，LaSota株与基因Ⅶ型的Y98F9株间的同源性为90．0％，而基因Ⅵ型的鸽源PB9601株与Y98F9株间的抗原同源性仅为74．2％，与LaSota株间的抗原同源性更低至65．2％。在交叉VI中，也表现出非常类似的同源性关系，LaSota株与Y98F9株间的同源性为90．1％，而鸽源PB9601株与Y98F9株间的同源性也仅为75％，与LaSota的同源性进一步低至65．8％。     

鸡新城疫强毒株的分离与致病特点

从有典型鸡新城疫病变的病鸡组织中分离到一株病毒，该病毒凝集鸡红细胞的作用可被新城疫标准阳性血清所抑制。对鸡胚最小致死量的稀度为10^-7，致死鸡胚的平均时间小于48h，1日龄雏鸡致死指数为1.82。血凝解脱及血凝素热稳定性等试验表明，分离毒为新城疫病毒强毒株，其毒力较标准强毒F48E8株稍强。血凝抑制试验和中和试验表明，分离毒的血凝性与F48E8相同，但中和特性与F48E8有差异。     

Immune protection assay of Newcastle disease live vaccine （LaSota Strain） against a genotype VII NDV isolate

从山东省发病鸡群分离鉴定了一株新城疫病毒（NDV）,命名为SDLY01。经蚀斑纯化后进行毒力测定和序列分析表明分离株SDLY01属于基因VII型NDV强毒。20只7日龄SPF鸡免疫新城疫活疫苗LaSota后14d分别用NDV标准强毒F48E8和分离株SDLY01攻毒,同时设同日龄SPF鸡为对照组,未免疫任何疫苗。攻毒后观察10d,免疫组在攻毒后食欲、精神均正常;对照组在攻毒后2～4d发病死亡,并表现ND典型的临床症状和病理变化。攻毒后第3、5、7、9d对免疫组试验鸡取喉头、泄殖腔棉拭进行病毒分离,F48E8攻毒组病毒分离均为NDV阴性,SDLY01攻毒组第5d病毒分离NDV阳性,第3、7和9d病毒分离阴性。本研究结果表明LaSota活疫苗对F48E8和SDLY01均能提供100％免疫保护,但不能完全抑制基因VIINDV分离株在体内的复制和排毒。     

3株单抗对新城疫病毒HN抗原变异的分析

以新城疫病毒(NDV)LaSota株为免疫原研制了3株针对NDVHN蛋白的单抗,分别命名为1E5、C3-B7和E6-F11。3株单抗与NDV不同毒株在血凝抑制试验(HI)、ELISA和病毒中和试验中的反应性不同,而同一株单抗与同一个NDV毒株在HI、ELISA以及病毒中和试验中的反应性一致。其中,单抗1E5与NDV标准株(LaSota、F48E8)、8个NDV分离株反应阳性,而与9个NDV分离株反应阴性;单抗C3-B7、E6-F11与所有NDV毒株反应均为阳性。结果表明,3株单抗均是针对HN蛋白上的中和位点,国内部分NDV流行株的HN抗原至少有1个抗原位点发生了变异。     

免疫鸭体内副黏病毒的分离及其F基因的分子特征

为分析当地鸭副黏病毒流行状况及其融合蛋白(F)基因的序列特征,从江苏省某新城疫疫苗免疫过的鸭群中分离到1株病毒,经血清学试验和中和试验鉴定为鸭副黏病毒,命名为JS0920株.生物学特性分析,9日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5.3；9日龄SPF鸡胚的最小致死量平均死亡时间(MDT)为47.7h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.875,6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定为2.7.用该病毒的培养物(鸡胚尿囊液)经肌肉注射攻毒,鸭的发病率为70％,死亡率为40％；鸡的发病率和死亡率均为100％.用RT-PCR方法扩增该分离毒株的F基因,序列分析表明,JS0920株与标准强毒株F48E9的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高,分别为99.2％和99.5％,与免疫预防用的LaSota株的同源性分别为89.0％和92.2％；其多肽裂解位点为112R-R-Q-R-R-F117,具有高致病性鸭副黏病毒毒株的分子特征；系统发育进化树分析,JS0920株与LaSota株的基因型不同,JS0920株为基因Ⅸ型,与F48E9株的亲缘关系最近.试验结果对认识当前DPMV的流行和变异现状以及疫苗研制具有重要的参考价值.     

鸡新城疫的流行与免疫

门诊病例统计表明，我国鸡群中ND的发病率仍非常普遍。近些年来，世界各地对NDV分离株的研究结果发现，其HN基因和F基因序列的某些位点发生的变化，致使毒株间的毒力差异较大，抗原性亦有差异，但其主要抗原表位未发生变化。山东家禽研究所禽病室对1998－1999年的6个NDV分离株做了比较研究，各毒株的毒力不同且都比经典的F48E9强，其中二个属基因Ⅶ型。但交叉免疫保护试验表明，用La Sota株弱毒苗及其灭活油乳苗免疫的鸡，在用这6个分离毒分别攻毒后，均有1005保护率。同样，用这6个分离毒制成的灭活油乳苗免疫鸡后，对经典毒E48F9亦产生100％保护率。这表明，从目前发病鸡群中分离的NDV毒株与La Sota弱毒株、标准F48E9强毒株间有很好的交叉免疫保护作用。     

蛋鸡输卵管积液中新城疫强毒的分离鉴定与分子特征

从病鸡输卵管积液中分离了一株新城疫病毒(命名为SHY06),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间和1日龄雏鸡脑内致病指数分别为52 h和2.0,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征.根据F基因(1-374 bp)对SHY06和19个NDV参考毒株进行基因分型结果表明SHY06属于基因Ⅶ型.F基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为97.5%～99.5%,与基因Ⅸ型NDV(F48E9等)同源性为91.7%～92.4%,与基因Ⅱ型(疫苗株LaSota等)同源性为89.2%. HN基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与近年来分离株同源性较高,为92.1%～99.7%,与疫苗株(LaSota)和标准强毒株(F48E9)同源性较低,分别为87.6%和89.9%.     

禽副粘病毒I型结构蛋白分析

鹅副粘病毒 YG97分离株、鸡源 V98分离株以及新城疫病毒 (NDV)F48E8、 LaSota和 C30毒株，鸽副粘病毒 YZPNF2分离株经鸡胚增殖纯化后，进行 SDS-PAGE电泳，结果显示 YG97和 Y98 2个毒株在 56kD处比另外 4个毒株多出一个条带。用单抗 2010株进行 Western blot转印，结果该单抗只对 YG97和 Y98 2个毒株的 56kD条带反应，证明这 2株病毒的结构蛋白与经典的新城疫病毒有着一定的差异。     

鸡新城疫病毒的分离鉴定与交叉免疫保护试验

为了评价疫苗免疫保护效果,进而筛选出最佳的免疫方案,将分离到的鸡新城疫病毒(Newcas-tle disease virus,NDV)流行毒株制备成灭活疫苗进行交叉免疫保护试验研究。把采集到的疑似发生新城疫的病鸡肺、气管环等组织经处理后接种10日龄SPF鸡胚进行病毒的分离和增殖,并用血清学和分子生物学方法进行毒株的鉴定;用分离到的NDV/Chicken/TC/1/2011毒株制成油乳剂灭活苗,与La Sota疫苗以不同的疫苗组合免疫SPF鸡,进行交叉免疫保护试验。结果显示,共分离到9株新城疫病毒,其F蛋白裂解位点的氨基酸均为112 R-R-Q-K-R-F117,表现为强毒株的分子特征,与致病指数结果一致。分离株灭活苗组和分离株灭活苗+La Sota弱毒苗对试验鸡的免疫保护力最高,其次是La Sota灭活苗+La Sota弱毒苗和LaSota灭活苗,La Sota弱毒苗对试验鸡的免疫保护力最低。NDV分离株与疫苗株La Sota存在明显抗原性差异,这将对新城疫疫苗的发展和疾病控制策略制定至关重要。     

鹅源副粘病毒NA-1株与鸡新城疫病毒F48E9株的抗原变异关系分析

对鹅源副粘病毒NA-1株和鸡新城疫病毒F48E9株进行鸡胚半数感染量（EID50）与半数细胞感染量（TCID50）的测定,并采用交叉血凝抑制试验、鸡胚交叉中和试验、细胞交叉中和试验、交叉动物保护试验的比较,确定2种抗原的抗原比值和相似程度。结果表明：前3个交叉中和试验的R值分别为0.446、0.50、0.56,表明2毒株确实存在抗原差异;交叉动物保护试验说明,对制苗毒株的保护率高于非制苗毒株,提示仅采用新城疫疫苗很难有效预防鹅副粘病毒病,应倡导用现地分离的毒株制苗。     

新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒（NDV）F基因序列设计了一对引物,用RT-PCR方法扩增了8个NDV贵州分离株的F基因片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1662bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.0%～99.7%和87.5%～99.3%,但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的氨基酸同源性为87.2%～97.7%。F蛋白裂解位点的氨基酸序列分别为112R-R-Q-R/K-R-F^117（其中P1、H2、N98、DQ、FW、BY、GZ7株为强毒）和112G-R-Q-G-R-L^117（TN1株为弱毒）。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明,4个分离株（P1、H2、、N98、DQ）为基因Ⅶ型,2株（GZ、TN）为基因Ⅱ型,2株（FW、BY）为基因Ⅸ型。     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的检测及HN、F基因序列分析

为了掌握辽宁省新城疫病毒(NDV)的分布特点,试验采用新城疫荧光RT-PCR方法检测到1株新城疫病毒,通过接种鸡胚分离鉴定后将其命名为CK/YK1/2013,通过PCR扩增得到HN、F基因全长片段并测定了基因序列。结果表明:该毒株可以使接种鸡胚在38 h内死亡,具备强毒株的生物学特性。CK/YK1/2013的F基因在裂解位点的氨基酸序列为111GGRQGRL117,与弱毒株LaSota序列相同,与其他已知强毒株的裂解位点不同。CK/YK1/2013的HN、F基因与Ⅱ型LaSota毒株的同源性为99.6%,与F48E9及Ⅶ型的同源性分别为89.1%和83.0%,基因进化树分析表明该毒株属于Ⅱ型NDV。     

不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

为阐明不同宿主及不同基因型新城瘦病毒(NOV)对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因VIId亚型NDV 6株,鸡源基因Ⅲ型和鸽源基因VIb型毒株各1株,以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验.在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品.以SYBR Green I Real-time PCR检测病毒最早出现时间及病毒载量.结果表明,6株基因VIId亚型NDV毒株导致SPF鸡100%发病,死亡率90%以上,属于高致病性毒株;基因Ⅲ、VIb型毒株导致SPF鸡发病但不死亡,属于中等毒力毒株.VIId亚型毒株与F48E9株攻毒后SPF鸡在病理变化、组织嗜性及病毒载量上没有显著差异.根据毒株的MDT、ICPI指数及攻毒鸡病程综合判断,VIId亚型毒株在致病性上与F48E9株差异不显著.健康野鸟携带基因VIId亚型高致病性NDV,在NDV的自然生态传播过程中起重要作用,提示应该加强对野鸟的流行病学监测及相关研究.     

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒（NDV）核苷酸序列，设计针对中、强毒力NDVF基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针，建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR（RRT—PCR）检测中、强毒力NDVRNA的方法。该方法能从舍有NDVI系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9（基因Ⅸ型）、分离鸡源强毒株（基因Ⅶ型）和鸽源强毒株（基因VI型）样本中检出NDVRNA，不与NDV弱毒株（LaSota、Clone30、B1、V4）、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒及健康鸡组织RNA发生交叉反应，对NDV核酸的最小检出量为60个拷贝，具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等特点。从9个临床样本中均检测出阳性信号（9／9），PCR产物经测序证明均舍有NDV强毒株F基因裂解位点；用其中8份病料接种SPF鸡胚分离病毒，分离率为5／8。     

云南2株基因Ⅱ型新城疫病毒F基因变异特性分析

对云南省2个发病鸡场的组织病料进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测,证明分离毒株为新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）。采用特异性引物经RT-PCR扩增F基因,纯化后克隆至pMD18-T载体,并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,分离获得的云南省2株 NDV毒株F基因核苷酸与La Sota株的核苷酸同源性为99.4%～99.6%,与国内外分离的流行毒株SP13和NDV027344核苷酸同源性均为99.7%～99.8%,与F48E9株的核苷酸同源性为89.0%～89.1%;F蛋白氨基酸与La Sota株的氨基酸同源性为99.3%～99.5%,与流行毒株SP13和NDV027344的氨基酸同源性均为99.5%～99.6%,与F48E9株的氨基酸同源性为91.8%～92.0%。系统发育分析结果表明,2株病毒均属于基因Ⅱ型,裂解位点氨基酸为G-R-Q-G-R-L,属于弱毒株裂解位点氨基酸排列特征。     

不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

为阐明不同宿主及不同基因型新城疫病毒（NDV）对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因Ⅶd亚型NDV6株,鸡源基因III型和鸽源基因Ⅵb型毒株各1株．以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验。在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品,以SYBR Green I Real-time PCR检测病毒最早出现时间及病毒载量。结果表明,6株基因Ⅶd亚型NDV毒株导致SPF鸡100％发病,死亡率90％以上,     

一株Class Ⅰ新城疫病毒中国分离株分子特性的研究

摘要：对从健康家鸭中分离到的一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株Duck／China／08—004／2008进行了遗传进化特性研究。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段。并进行了克隆与序列分析。序列测定结果已经登录到GenBank,登录号为EU589149。该分离株F蛋白裂解位点的组成为112E—Q—Q—E—R—L117,具有典型新城疫弱毒株的分子特征。同源性分析表明其与国内普遍使用的弱毒疫苗株LaSota和V4核苷酸的同源性较低（分别为55．4％和57．7％）。通过构建F基因的遗传进化树,结果表明该分离株在分类地位上属于Class Ⅰ,与我国目前普遍使用的弱毒疫苗株LaSota（Class Ⅱ中的基因Ⅱ型）和V4（ClassⅡ中的基因Ⅰ型）处在不同的进化分支。通过构建57株ClassⅠ新城疫病毒的遗传进化树．表明本分离株与近年来香港活禽市场分离株较为类似．同属于基因3型。