用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记

采用生物素-磁珠富集法与放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了史氏鲟Acipenser schrencki基因组的微卫星资源。结果表明:在得到的1 400多个细菌中,有300多个阳性克隆,将其中96个进行测序,在这些序列中共有115个微卫星核心序列,含99个重复次数大于10次的微卫星核心序列。其中完美型标记40个,占40.4%;非完美型标记52个,占52.5%;混合型标记共7个,占7.1%。随机选取侧翼序列较长的50个序列,依据引物设计原理设计引物50对,经3次PCR筛选,有28对引物可得到稳定的特异性扩增;同时利用史氏鲟的6个个体检验了这些位点的多态性,并统计了等位基因数,发现有22对等位基因具有良好的多态性。     

用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记

采用生物素-磁珠富集法与放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了史氏鲟Acipenser schrencki基因组的微卫星资源。结果表明:在得到的1 400多个细菌中,有300多个阳性克隆,将其中96个进行测序,在这些序列中共有115个微卫星核心序列,含99个重复次数大于10次的微卫星核心序列。其中完美型标记40个,占40.4%;非完美型标记52个,占52.5%;混合型标记共7个,占7.1%。随机选取侧翼序列较长的50个序列,依据引物设计原理设计引物50对,经3次PCR筛选,有28对引物可得到稳定的特异性扩增;同时利用史氏鲟的6个个体检验了这些位点的多态性,并统计了等位基因数,发现有22对等位基因具有良好的多态性。     

用磁珠富集法快速制备银鲫微卫星标记

将磁珠富集法和用γ-32P标记的放射性探针法相结合,快速制备银鲫Carassius auratus gibelio微卫星。用限制性内切酶MboI对银鲫完整基因组DNA酶切,用不同蔗糖浓度梯度离心收集400~900 bp大小的片段,连接Brown接头,构建银鲫全基因组文库。用生物素标记的(CA)16寡核苷酸探针进行筛选,磁珠富集含有微卫星的DNA单链序列;对DNA模板进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入用CaCl2制备的感受态大肠杆菌Escherichia coliDH5α中,得到微卫星序列文库;经用同位素γ-32P标记的探针(CA)16二次筛选,获得235个阳性克隆,对其测序,得224个含微卫星序列,完美型、非完美型、复合型序列分别占总数的52.8%、28.7%、18.5%。除探针中使用的(CA/GT)n重复单元外,还观察到(GA/CT)n、(ACTC)4的重复序列。设计163对引物,选择合成30对引物,经聚丙烯酰胺凝胶筛选,9对可以获得清晰条带,其中3对为单态,6对为多态。     

用磁珠富集法快速制备银鲫微卫星标记

将磁珠富集法和用γ-32P标记的放射性探针法相结合,快速制备银鲫Carassius auratus gibelio微卫星。用限制性内切酶MboI对银鲫完整基因组DNA酶切,用不同蔗糖浓度梯度离心收集400⁹00 bp大小的片段,连接Brown接头,构建银鲫全基因组文库。用生物素标记的(CA)16寡核苷酸探针进行筛选,磁珠富集含有微卫星的DNA单链序列;对DNA模板进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入用CaCl2制备的感受态大肠杆菌Escherichia coliDH5α中,得到微卫星序列文库;经用同位素γ-32P标记的探针(CA)16二次筛选,获得235个阳性克隆,对其测序,得224个含微卫星序列,完美型、非完美型、复合型序列分别占总数的52.8%、28.7%、18.5%。除探针中使用的(CA/GT)n重复单元外,还观察到(GA/CT)n、(ACTC)4的重复序列。设计163对引物,选择合成30对引物,经聚丙烯酰胺凝胶筛选,9对可以获得清晰条带,其中3对为单态,6对为多态。     

磁珠富集法开发长臀鮠微卫星分子标记

为长臀鮠遗传育种、种质鉴定和种苗流放等提供理论依据,采用磁珠富集法开发长臀鮠(Cranoglanis bouderius)微卫星分子标记,筛选获得阳性克隆进行分析,选取侧翼较长的序列,用Primer Premier 5.0设计合成引物。结果表明:从596个白斑中筛选获得80个阳性克隆,测序获得微卫星序列47个,其中完美型31个(66%),非完美型14个(30%),复合型2个(4%)。设计合成32对引物,通过优化反应条件,得到27对引物能扩增特异条带,其中多态性引物24对。     

利用磁珠富集法开发花榈木微卫星引物

将花榈木(Ormosia henryiPrain)基因组DNA用MseⅠ酶切后,连接相应的接头,PCR扩增后回收500~1000bp片段,与用生物素标记的微卫星探针(GA)12,(AAG)8杂交后,运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。获得的序列经PCR扩增,连接载体pMD19-T,构建富含微卫星序列的小片段插入文库;用PCR法筛选文库,获得78个阳性克隆,经测序分析得到24个微卫星序列,成功设计出9对引物。     

乌鳢微卫星DNA分子标记的分离及筛选

利用磁珠富集法结合放射性同位素杂交方法分离乌鳢Ophiocephalus argus的微卫星分子标记,共获得阳性克隆1 200个,从中挑选466个进行测序,得到400个含有微卫星的序列(占86.6%)。结果表明:完美型微卫星座位325个,占76.11%;非完美型微卫星座位75个,占17.57%;复合型微卫星座位27个,占6.32%。在得到的微卫星序列中,重复单元除CAG/GTC外,还观察到二碱基重复单元。根据侧翼序列设计引物139对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有27对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,19对引物在黑龙江群体、山东群体乌鳢的DNA样本中表现出多态性。     

乌鳢微卫星DNA分子标记的分离及筛选

利用磁珠富集法结合放射性同位素杂交方法分离乌鳢Ophiocephalus argus的微卫星分子标记,共获得阳性克隆1 200个,从中挑选466个进行测序,得到400个含有微卫星的序列（占86.6%）。结果表明：完美型微卫星座位325个,占76.11%;非完美型微卫星座位75个,占17.57%;复合型微卫星座位27个,占6.32%。在得到的微卫星序列中,重复单元除CAG/GTC外,还观察到二碱基重复单元。根据侧翼序列设计引物139对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有27对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,19对引物在黑龙江群体、山东群体乌鳢的DNA样本中表现出多态性。     

刺参微卫星DNA分子标记的分离及筛选

采用磁珠富集法分离刺参Apostichopus japonicus的微卫星分子标记,共获得阳性克隆123个,其中106个含微卫星DNA序列。分析结果表明:完美型有48个,占45.28%,非完美型有39个,占36.79%,复合型有19个,占17.92%;重复碱基数以双核苷酸重复最常见,占84.91%,双核苷酸中又以CA/GT重复所占比例最大;在重复次数方面,以重复数为3~10次、11~18次和≥35次最为常见,各占39.62%、26.42%和16.98%,重复数达100次以上的有5个,最多的达到148次,有28个微卫星序列微卫星含量丰富。筛选的22对引物中,可产生出扩增产物的有17对,其中16对引物的产物带在预测区域内出现;有7对引物在中国、俄罗斯刺参模板中表现出多态性。文中还对刺参微卫星的特点进行分析,对刺参微卫星引物的PCR筛选结果进行了探讨。     

许氏平鲉微卫星标记的开发及评价

采用磁珠富集法筛选具多态性的许氏平鲉微卫星标记,并用一个野生群体对其多态性进行了评价。三引物PCR法筛选出58个阳性克隆进行了测序,共得到47个含微卫星核心的DNA序列,筛选出15对具有多态性的微卫星引物。所有位点上共得到66个等位基因片段,每个位点的观测等位基因数(A)为2~14个,平均等位基因数为4.4,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)范围分别为0.062 5~0.968 8、0.061 5~0.929 1。每个位点的多态信息含量(PIC)显示,有6个位点表现出高度或中度多态。经Bonferroni校正后,HJ2-32、HJ4-27、HJ4-45和HJ4-47四个位点的等位基因频率显著偏离了Hardy-Weinberg平衡。连锁不平衡检测表明,各位点间无连锁不平衡现象。     

基于柿雌雄花芽转录组测序的SSR和SNP多态性分析

为深入开发柿SSR和SNP分子标记,进而推动柿品种鉴定和遗传多样性等研究,以‘禅寺丸’柿的雌雄花芽转录组序列为基础,对SSR和SNP位点进行发掘。结果表明:转录组测序获得了154 741条unigene,其中有38.49%unigene在数据库中得到注释。利用MISA软件进行SSR位点的搜索,共得到44 304个SSR,包含83种重复基元,其中以A/T类型为主的单核苷酸重复所占的比例最高(20 006个,占47.63%),其次是以AG/CT类型为主的二核苷酸重复(16 055个,占38.23%),再次是以AAG/CTT类型为主的三核苷酸重复(5 402个,占12.87%)和以AAAG/CTTT类型为主的四核苷酸重复(500个,占1.19%)。在转录组得到的unigene中共发现SNP 405 685个,发生频率为1/253bp。6种单核苷酸变异中,转换类型发生频率显著高于颠换类型,转换类型中的C/T(31.51%)和A/G(31.41%)发生频率最高,在颠换类型中A/T发生频率最高。柿SSR和SNP的位点是非常丰富的,可为柿遗传图谱构建、遗传多样性和亲缘关系研究提供丰富的基础数据信息。     

颐和园古柿树组织培养快繁体系的建立

以北京颐和园的古柿树当年新生的嫩芽切段为外植体进行组培快繁研究。结果表明,不定芽启动培养基为1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 g/L PVP。将无菌苗转接到最适分化培养基( 1/2MS +5.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5 g /L PVP)上,组培苗分化效率较高,但小苗矮小。将分化较好的组培苗转接到壮苗培养基（1/2MS+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L IAA+0.5 g/L PVP）,待组培苗长至 2~3 cm 转到生根培养基（1/2MS +0.6 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA+0.5g/L PVP）,暗培养9~10 d后转接到生根培养基（ 1/2MS + 0.5 g/L PVP）,生根率为30%。而将组培苗茎段预先用250 mg/L 的IBA或IAA浸泡2min,生根率可提高到40%。生根组培苗经炼苗后移栽成活率可达60%。     

西太公鱼微卫星的筛选与分析

利用磁珠富集法从西太公鱼（Hypomesus nipponensis）基因组中筛选到14对多态性微卫星引物,并对来自黑龙江镜泊湖的西太公鱼24个样本进行检测：扩增的等位基因数在3～25个之间,平均为8.4个;观察杂合度（H_O）和期望杂合度（H_E）分别为0.266 7～1.000 0和0.282 5～0.932 2;多态信息含量（PIC）为0.239 2～0.910 6;位点HN-075和位点HN-250显著偏离哈迪-温伯格平衡（P<0.05）,这些多态性微卫星位点可用于公鱼属鱼类种群遗传结构及其相关研究。     

三疣梭子蟹微卫星文库的构建及序列分析

采用磁珠富集法筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星序列。经Sau3AI酶切后的200~1000bp DNA纯化片段,与两端已知序列的人工接头连接,用含有生物素标记的(CA)₁₂和(GA)₁₂探针杂交,根据磁珠的链酶亲和素与生物素特异结合的特性,捕获含微卫星序列的单链DNA,以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,随后将获得的片段连接到PMD18-T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,成功构建了微卫星富集文库。测序其中的60个阳性克隆,得到42条微卫星序列(基因登录号为:HQ283153-HQ283194),除探针使用的CA/GT、GA/CT重复外,还得到GAGT重复序列。42条微卫星序列中,完美型31个(占73.8%),非完美型9个(占21.4%),混合型2个(占4.8%)。完美型的比例显著高于非完美型,这与其他真核生物微卫星序列的特征相一致。39条微卫星序列的重复次数大于10(占92.9%),其中,重复次数在10~19次之间的有27个,20次以上的有12个。筛选出的微卫星位点可为今后三疣梭子蟹遗传多样性评价、种群遗传结构鉴定及资源保护研究提供一套有用的分子标记。     

柿属新种德阳柿花芽分化的形态学观察

【目的明确柿属新种德阳柿各花器官原基出现的大致时间,以及花性别分化早期的形态学差异。【方法以10年生德阳柿雌株和雄株为材料,采集现蕾前的混合芽以及现蕾后的雌花和雄花,拍照记录其外部形态;同时利用扫描电镜和常规石蜡切片法,观察雌花和雄花各花器官原基以及性细胞的发育过程。【结果以休眠期为时间节点,德阳柿雌、雄花芽的发育过程可分为花芽分化前期和花芽分化后期。分化前期为6-7月,该阶段雌、雄花芽的发育进程基本一致,首先在叶原基基部出现花分生组织,然后依次形成苞叶原基、萼片原基和花瓣原基;分化后期为次年3-5月,雌、雄花芽解除休眠后,再依次分化出雄蕊原基和心皮原基。雄花芽解除休眠的时间早于雌花芽,雄花形成雄蕊原基和心皮原基的时间较雌花早17 d。随后,雄花和雌花进入性细胞发育时期。雄花雄蕊内部会产生初生造孢细胞团,造孢细胞继续分裂发育直到形成成熟花粉粒;雌花心皮原基基部形成子房,内部产生胚珠原基,随后胚珠分化发育,最终产生成熟胚囊;雌、雄花性细胞发育成熟的时间基本一致。【结论】德阳柿花芽分化跨2个年度进行,在萼片原基分化期和雄蕊、心皮原基分化期,雌花芽和雄花芽表现出明显的形态学差异。     

亲和素磁珠分离毛竹SSR标记方法的优化

在参考其它文献报道的基础上,构建毛竹SSR位点富集文库。用EcoRⅠ分别和DraⅠ、EcoRⅤ、SmaⅠ、PvuⅡ四种平端限制性内切酶对毛竹基因组DNA进行双酶切,酶切片段回收后与根据抑制性PCR原理设计的接头连接。在利用亲和素磁珠富集含有SSR序列的DNA片段过程中,对杂交、漂洗及洗脱步骤进行优化。通过三引物特异PCR筛选含有SSR序列的阳性克隆并结合测序结果对富集SSR文库进行评价,确定了一条简单、经济、高效分离竹类植物SSR标记的方法。     

柿单宁细胞形态特征及发育动态研究

观察了4个类型(PCNA,PVNA,PCA,PVA)103个柿品种果实中单宁细胞的形态特征。结果表明,单宁细胞与果肉细胞不论是否染色均有明显区别,即使在花期子房中单宁细胞与果肉细胞也能明显区分;单宁细胞随着果实发育而增大;不同品种不同果实及同一果实内,单宁细胞的外形、大小、表面特征表现得多种多样,成熟果实软化后的单宁细胞形状大致可分为6类,即细长形、长形、椭圆形、近圆形、多角形、尖头形;单宁细胞的表面形态也分为棘刺状、瘤状、凹陷状和自然平滑状。成熟果实中单宁细胞的大小是幼果期单宁细胞的3倍左右;在果实中,单宁细胞主要存在于中果皮,中果皮的单宁细胞无论何种形状,均较外果皮中形状相似的单宁细胞大2倍左右;除以单个分散形式存在外,在有些品种中单宁细胞以单宁细胞束或单宁细胞团的形式存在。完全甜柿与完全涩柿单宁细胞的发育动态不尽相同。     

变态前牙鲆cDNA文库中I型微卫星的多态性分析

牙鲆（Paralichthys olivaceus）不仅是研究鱼类变态的模式生物,也是我国的重要水产养殖对象。从变态前牙鲆cDNA文库中的42个单一序列表达标签(ESTs)中筛选到46个微卫星分子标记,从中选择21个微卫星并在一个养殖牙鲆群体共30个样本中测试,结果表明其中有20个微卫星标记具有多态性,其等位基因数为2到6个,观察杂合度从0.06到1.00,期望杂合度从0.059 7到0.825 2变化不等,平均多态信息含量是0.457 5,可用于牙鲆连锁图的构建和分子标记辅助选育。其中,有3个微卫星位点的三核苷酸重复序列在基因编码区内,可能和基因功能有关。