家蚕热激蛋白Hsp25.4对BmNPV增殖的影响

【目的】探究家蚕热激蛋白（Hsp25.4）基因在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrovirus,Bm NPV）侵染家蚕后的表达变化规律,明确敲低该基因表达后对BmNPV增殖复制的影响,为深入解析BmHsp25.4蛋白在BmNPV侵染家蚕过程中发挥的作用提供参考依据。【方法】以5龄家蚕幼虫为研究对象,经口添食10μL预先制备好的BmNPV-T3株病毒悬液（5×108个/mL）,对照组添食等量灭菌水,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因在BmNPV侵染6 h各组织的表达情况,并选择相对表达量较高的3个组织,分析BmHsp25.4基因时空表达图谱;注射双链RNA(dsRNA)检测BmHsp25.4基因在体内的干涉效果,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因干涉后对BmNPV增殖复制的影响。【结果】BmNPV侵染家蚕6 h,BmHsp25.4基因在家蚕血液、中肠和脂肪体组织中的相对表达量升高;时空表达谱结果显示,BmHsp25.4基因在3个组织中的表达谱均呈先升高后降低的变化趋势,其中血液和中肠组织的相对表达量均在6h达峰值,而脂...     

蚯蚓提取液对家蚕热激蛋白水平及免疫功能的影响

为探讨蚯蚓提取液对家蚕热激蛋白的表达及免疫功能的影响,家蚕5龄幼虫饲喂蚯蚓提取液(50、100和200倍原液稀释)处理的桑叶,饲喂6 d后解剖获取家蚕中肠及血淋巴组织,利用实时荧光定量PCR检测中肠组织中HSP70和HSP90基因的表达;利用ELISA试剂盒检测中肠和血淋巴中HSP70、HSP90、溶菌酶(lysozyme)和抗菌肽(attacin)的水平。结果表明:1/100和1/200稀释组家蚕中肠组织中HSP70基因表达分别是对照组的2.97和1.86倍(P<0.05),1/100稀释组家蚕中肠组织中HSP90基因表达是对照组的2.2倍(P<0.05);1/50稀释组中肠HSP70和血淋巴抗菌肽显著高于对照组(P<0.05);各处理组中肠和血淋巴中HSP90差异不显著(P>0.05)。由此可见,桑叶中添食蚯蚓提取液可促进热激蛋白的表达,提高抗菌肽的水平,进而提高蚕体的抗性和免疫功能。     

热激蛋白与果实的发育和贮藏

本文对热激蛋白的研究进行了简明介绍,包括热激蛋白的概念,分类,发现及发展。着重阐述了热激蛋白在果实发育成熟及贮藏方面的研究进展,以及今后热激蛋白在该领域的研究前景。     

植物中热激蛋白的研究进展

高温是影响当前农业生产的重要不利环境因素之一。当植物受高温胁迫时会产生应激反应,降低正常基因的表达,并启动热激基因产生热激蛋白,以使植物顺应高温环境。热激蛋白在进化上是高度保守的,可以分为五大类,其中低分子量的热激蛋白是植物热激反应所特有的。很多热激蛋白的表达都受到转录因子的控制,目前已清楚热激蛋白基因的功能及表达调控机制。与耐热性相关的信号传递途径,以及整个信号传递网络系统的机理将是今后研究的热点。     

昆虫热激蛋白的研究进展

热激蛋白是细胞或生物体受到逆境胁迫后大量合成的一类在进化上高度保守的蛋白质,普遍存在于原核生物和真核生物中,在昆虫抵抗逆境胁迫的过程中起到了非常重要的作用。本文根据近年来国内外对热激蛋白的研究现状,对昆虫热激蛋白的分类、生物学特性等进行了概述,总结了热激蛋白的生物学特性,分析了热激蛋白作用的特点,并讨论了热激蛋白在系统发育分析、环境监测及害虫防治等方面的应用前景,为相关领域的研究提供一定的理论依据。     

植物小热激蛋白及其生物学功能研究进展

植物中的小热激蛋白(sHSPs)含量丰富,种类繁多。除高温外,sHSPs还被其他多种胁迫诱导,亦能受植物正常发育过程调控。sHSPs由核基因编码,其典型特征是有1个保守的α-晶状体蛋白域结构。通常植物sHSPs具有分子伴侣功能,在不依赖ATP的情况下阻止变性蛋白的聚集,从而对植物抵抗、适应胁迫环境以及生长发育起着重要作用。文章对植物中sHSPs的种类、蛋白结构特征和生物学功能进行了综述。     

热激对家蚕后部丝腺磷酸化蛋白质组的影响

为了探索蛋白质磷酸化在高温环境胁迫中发挥的作用,以秋丰×白玉家蚕为试验材料,将5龄第3天的家蚕放置在40℃培养箱内热激10 min,以未热激的家蚕为对照,利用双向电泳和质谱技术对后部丝腺磷酸化蛋白进行了分析和鉴定。结果发现,与对照相比,9个磷酸化蛋白在短期的热激之后表达量下降,包括腺苷酸激酶,延伸因子EF-1δ、EF-1β',核糖体蛋白P0、P1、P2以及轻链丝心蛋白等。GO分析表明,这些蛋白质主要参与能量代谢和丝心蛋白合成。对以上磷酸化蛋白的结构和功能进行分析,并利用Net Phos工具进行磷酸化位点预测,结果表明,这些蛋白质二级结构主要以α螺旋或无规则卷曲为主,无跨膜结构域,均存在磷酸化修饰。     

植物热激蛋白研究进展

论述了植物热激蛋白的研究进展,对植物热激蛋白的产生和分布,热激蛋白在温度逆境下的响应机制及其生理功能和基因表达调控等方面进行了概述,并提出了热激蛋白研究中存在的问题及今后的研究方向。     

棉花热激蛋白产生规律的初步研究

为探讨棉花热激蛋白（ＨＳＰ）的产生规律、选用湖北省推广的优势主产棉花品种鄂棉１６放鄂抗棉３号，采用电泳、扫描等技术对棉花ＨＳＰ进行初步研究，结果表明，热激处理可以诱导一系理ＨＳＰ的合成，同时关闭或抑制正常蛋白质的合成。ＨＳＰ诱导合成的最适条件是４２℃、２ｈ，但最适热激处理时期因品种不同而异；鄂棉１６为萌动期和一叶期，鄂抗棉３号为子叶期生叶期。     

家蚕幼虫各发育时期酚氧化酶原基因的转录活性分析

[目的]为进一步了解家蚕酚氧化酶原基因的功能奠定基础。[方法]根据GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的cDNA序列设计2对特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测家蚕幼虫各发育时期(蚁蚕到5龄起蚕)酚氧化酶原基因的转录活性。[结果]PPO1和PPO2基因在家蚕幼虫各发育时期的转录活性存在较大差异。PPO1基因在2龄眠蚕、4龄眠中的表达量最高,其次是2龄起蚕、3龄眠蚕3、龄起蚕和1龄眠蚕,在3龄眠中、4龄起蚕的表达量较低,在4龄眠蚕有弱表达,在其他发育时期几乎无表达。PPO2基因除了在蚁蚕1、龄眠中、2龄眠蚕无表达外,在其他时期的表达量均较高。[结论]酚氧化酶原基因在家蚕幼虫各发育时期的转录表达均具有明显的时空特异性。     

家蚕不同品种蛹期血淋巴酯酶同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,检测了85个家蚕品种的蛹期血淋巴酯酶同工酶酶谱,并对部分品种进行了聚类分析。结果表明,不同家蚕品种蛹期血淋巴酯酶同工酶酶带类型丰富,最多显现13条酶带,可区分为A、B、C三个染色区。利用酯酶同工酶酶谱对部分家蚕品种进行聚类分析,结果分别依中国系统、13本系统、欧洲系统各聚为一类。     

家蚕神经肽促前胸腺激素基因mRNA的发育表达

[目的]研究家蚕神经肽促前胸腺激素基因mRNA的发育表达。[方法]采用荧光定量PCR方法,研究家蚕5龄幼虫、预蛹期、蛹期和成虫4个阶段脑—咽下神经节复合体中PTTH基因的mRNA表达量变化。[结果]5龄幼虫PTTH基因mRNA表达量高于预蛹期、蛹期和成虫3个阶段;5龄第6天PTTH基因mRNA表达量最高,蛹期4～8d时持续维持较高表达水平,化蛾前表达量又有所降低,成虫表达量最低。[结论]家蚕PTTH基因mRNA的发育表达变化可能与其调控蜕皮激素合成的功能有关。     

家蚕iap基因在原核表达系统中的表达

为研究IAP蛋白抑制细胞凋亡的作用,用PCR法扩增出家蚕iap基因的cDNA,然后插入pET28a载体,得到阳性质粒pET28a-iap,并转化感受态细胞BL21,使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导IAP蛋白的表达,应用SDS-PAGE和Western Blotting法分析目的蛋白,得到一条分子量约为38.8 kDa的特异表达条带,与表达产物的理论值相符。为进一步研究BmIAP蛋白的功能奠定了基础。     

家蚕一种hAT家族转座酶基因的分析

[目的]对家蚕中一个潜在的hAT家族转座酶编码基因BmhAT进行分析.[方法]通过生物信息学方法,分析BmhAT转座酶的结构域及序列同源性.采用Real-time PCR方法,对BmhAT在野蚕及家蚕不同品种中的拷贝数进行分析以及在mRNA水平上测定BmhAT在家蚕不同组织中的相对表达量.[结果]BmhAT与许多hAT家族转座酶在序列上有很高的同源性,并具有hAT家族转座酶的保守结构域;BmhAT在家蚕基因组中存在约3-6个拷贝;在家蚕后部丝腺和脂肪体中的表达量分别是参照基因actin 3的0.4倍和0.6倍.[结论]BmhAT可能是家蚕中一个有活性的转座酶基因,编码家蚕一种新的hAT家族转座酶.     

家蚕IAP互作蛋白的筛选、鉴定及其对BmNPV增殖的影响

目的 细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白（Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP）的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。方法 利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。结果 通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmpp5的表达量显著下调,表明Bmiap能够促进Bmpp5的表达;同时,过表达Bmpp5后,Bmiap显著上调表达,而敲除Bmpp5后,Bmiap显著下调表达,表明Bmpp5同样能够促进Bmiap的表达;过表达Bmpp5能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmpp5能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmpp5的表达利于BmNPV的增殖。结论 鉴定了1个能够与BmIAP相互作用的蛋白BmPP5,且该蛋白在昆虫中高度保守;在BmNPV侵染过程中,Bmiap和Bmpp5能够相互促进,且Bmpp5能够促进BmNPV的复制增殖。     

家蚕热休克蛋白HSP60相互作用蛋白筛选与鉴定

【目的】 HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】 利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术（LC-MS/MS）,首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】 免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated（IP）用α-Flag抗体孵育,immunoblotting（IB）再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】 鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。     

作物热激蛋白研究进展及应用

热激蛋白(Heat Shock Protein,HSP)是生物体在多种刺激下产生的一种蛋白质.主要阐述了HSP的发现和研究概况,综述了HSP的种类及定位,HSP与植物的耐热性、抗冷性、作物品质以及与种子发育的关系;介绍了HSP在作物育种、生长发育及凋亡中的作用.     

家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定

[目的]HSP90是热休克蛋白家族的成员之一,在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用,已有研究表明HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖,但作用机制尚不清楚.本研究通过鉴定BmHSP90的相互作用蛋白,为其促进BmNPV增殖的作用机制解析提...