诱导子对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累的影响

[目的]雷公藤甲素是雷公藤主要药用活性成分之一,具有抗肿瘤、免疫抑制和抗炎等多种作用.应用植物细胞培养技术生产雷公藤甲素具有重要意义,而诱导子是提高植物细胞培养中次生代谢产物积累的有效途径之一.研究通过探究非生物和生物诱导子对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累的影响,以期提高雷公藤甲素产量,为雷公藤悬浮细胞规模化生产雷公藤甲素等药用活性物质提供基础.[方法]以水杨酸(SA)、LaCl3以及雷公藤内生真菌NS-5、NS-17作为诱导子,研究不同类型及不同浓度诱导子添加对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累及细胞活力、细胞生长、总糖消耗、PAL活性的影响.[结果]SA、LaCl3和内生真菌NS-5、NS-17诱导子均可促进雷公藤悬浮细胞培养物中雷公藤甲素的积累.非生物诱导子的效应大小受其浓度的影响,0.1 mg/L的SA诱导作用最好,可提高细胞活力,促进细胞生长,总糖消耗增加,升高PAL活性,雷公藤甲素产量最高是对照的3.5倍.随着浓度的降低,LaCl3对雷公藤甲素的诱导作用增强,20 mg/L LaCl3诱导下的最高含量是对照的2.0倍,同时20 mg/L LaCl3也提高了PAL活性和总糖消耗,但对细胞活力和细胞生长影响不大.内生真菌诱导子的效应大小即与诱导子种类和添加时间有关.细胞培养第4天添加NS-5、NS-17菌丝体提取物,第8天添加任一内生真菌诱导子均提高了雷公藤甲素的积累,其中NS-5菌丝体提取物的诱导效果相对最强,细胞培养第8天添加时雷公藤甲素产量最高,是对照的2.4倍,但雷公藤甲素的积累与细胞生长及PAL活性无明显的关联.[结论]诱导子的添加能够提高雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素的积累,诱导效应的大小与诱导子种类、添加浓度及添加时间有关.本研究中的0.1 mg/L SA、20 mg/L LaCl3及内生真菌NS-5菌丝体提取物显示了良好的诱导效果,在利用细胞培养技术进行雷公藤甲素生产中具有较好的应用前景.     

雷公藤甲素提取方法优化

本文采用L16(45)正交试验方法,研究超声提取法中料液比、甲醇浓度、超声时间和中性氧化铝用量对雷公藤甲素提取率的影响,从而优化雷公藤甲素提取方案.结果表明,料液比、甲醇浓度、超声时间、中性氧化铝用量对雷公藤甲素的提取率均有影响,中性氧化铝用量对雷公藤甲素的提取率有极显著的影响,甲醇浓度次之,超声时间对雷公藤甲素的提取率影响最小;当甲醇的浓度为80%,液料比为1∶35,超声时间为25 min,中性氧化铝的用量为5 g时,雷公藤甲素提取率最高.     

HPLC测定不同套种模式下雷公藤不同部位甲素含量

[目的]以厚朴/雷公藤(处理①)、杉木/雷公藤(处理②)、马尾松/雷公藤(处理③)为3种套种模式,雷公藤纯林为CK对照组,建立不同套种模式下雷公藤甲素的HPLC测定方法,并对不同套种模式下雷公藤不同部位甲素的含量进行比较。[方法]采用高效液相色谱法(HPLC),色谱柱为SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为甲醇-水(体积比45∶55);流速1.0 mL/min;检测波长218 nm;柱温40℃;进样量20μL。[结果]该方法能在8 min左右实现雷公藤甲素的快速分离,雷公藤甲素浓度在1.55～248.00μg/mL与峰面积线性关系良好(R~2=0.999 7),平均加样回收率为99.6%,RSD为1.85%(n=6)。[结论]该方法易操作、分析速度快、重现性好、准确率高,可作为雷公藤甲素含量的测定方法。不同套种模式下雷公藤甲素总含量从高到低依次为处理①、CK、处理②、处理③,雷公藤不同部位的雷公藤甲素含量从高到低依次为根、叶、茎,说明厚朴林下套种雷公藤的模式可提高雷公藤甲素的含量,因此可作为优质林药间作模式广泛推广。     

雷公藤内生真菌对Fusarium nisikadoi NS-1雷公藤甲素合成的影响

为了解雷公藤内生真菌的雷公藤甲素合成能力以及内生真菌间互作对雷公藤甲素合成的影响,本试验从雷公藤中筛选出1株产雷公藤甲素的内生真菌NS-1,鉴定为Fusarium nisikadoi;通过NS-1与其它内生真菌共培养,发现青霉菌属(Penicilliumn)内生真菌NS-8能够显著促进NS-1的雷公藤甲素合成(P<0.05),是对照的1.6倍.以此为基础,通过制备和添加NS-8菌丝体提取物和发酵液诱导子,进一步研究内生真菌NS-8诱导子对NS-1雷公藤甲素合成的影响.结果表明,NS-8发酵液诱导子促进了NS-1的糖消耗速率,提高了NS-1生物量和培养液pH值,明显促进了NS-1胞外雷公藤甲素的积累,最高含量是对照的4.2倍;NS-8菌丝体提取物诱导子对培养液pH值的影响不显著,NS-1糖消耗速率略有下降,对NS-1生长有一定的抑制作用,胞外雷公藤甲素含量低于对照.两种诱导子对NS-1胞内雷公藤甲素合成均未呈现明显的促进作用.因此,NS-8主要通过其代谢产物强化NS-1雷公藤甲素的合成.     

雷公藤愈伤细胞悬浮培养生产雷公藤甲素的研究

对雷公藤叶愈伤组织进行悬浮培养,研究不同营养条件对雷公藤愈伤细胞生长及其雷公藤甲素质量分数的影响.结果表明：悬浮细胞在White培养基上增殖最快,而在MS培养基上生长最慢;White和MS培养基中悬浮细胞在第6天时雷公藤甲素质量分数最高,分别为7.14 mg/g和4.77 mg/g,而N6培养基中雷公藤甲素最大产量为6.34 mg/g,出现在第9天;3组细胞培养悬浮液中的雷公藤甲素峰值产量分布规律为White（28.13μg/mL）〉N6（21.27μg/mL）〉MS（16.27μg/mL）,同时培养基的pH随细胞的生长有波动现象.     

雷公藤浙藤1号的特征特性及繁育技术

浙藤1号是浙江省中药研究所有限公司以新昌野生雷公藤为种源,经过多年驯化而来的雷公藤新品种,具有性状稳定、药用部位产量高、雷公藤甲素含量高等优点。主要介绍该品种特征特性和繁育技术。     

雷公藤甲素提取方法研究

以雷公藤叶为原料,采用浸提法提取雷公藤甲素.选择不同提取溶剂、提取时间、提取次数和料液比进行提取,以高效液相色谱法测定提取物中雷公藤甲素含量,采用梯度试验、对比试验、数量统计,得到最佳浸提参数为:提取溶剂为70%甲醇,提取时间6 h,提取3次,提取料液比为1:6(w/v).     

SPE-HPLC法测定雷公藤半成品及制剂中四种成分的含量

采用BRP固相萃取小柱纯化、高效液相色谱法同时检测雷公藤干浸膏、雷公藤片、雷公藤多苷片中四种成分的含量,采用Kromasil C₁₈(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,乙腈、甲醇、0.5%磷酸、水作为流动相梯度洗脱,建立固相萃取-高效液相色谱法同时测定雷公藤半成品、制剂中雷公藤甲素、雷公藤红素、去甲泽拉木醛和雷公藤内酯甲4种成分含量测定方法。结果表明,雷公藤甲素、雷公藤红素、去甲泽拉木醛和雷公藤内酯甲的线性关系良好(r≥0.996),加样回收率平均值分别为92.50%、94.93%、99.36%、92.29%,RSD分别为4.70%、6.41%、5.90%、4.36%。     

雷公藤甲素超临界萃取工艺研究

为了建立快速提取检测雷公藤甲素的分析方法,本试验研究了雷公藤根皮、不定根和发状根中雷公藤甲素的超临界CO_2(SFE-CO_2)萃取工艺,并使用液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)检测雷公藤甲素含量。结果表明:超临界CO_2萃取根皮中甲素较适宜条件为:萃取压力48.265 MPa,萃取温度35℃,改性剂正丁醇、静态萃取时间15min及CO_2体积25 mL。超临界CO_2萃取不定根和发状根中甲素较适宜条件为:萃取压力27.580 MPa,萃取温度55℃,改性剂乙醇、静态萃取时间20 min及CO_2体积25 mL。添加回收率为80%~107%,相对标准偏差(RSD)为7.7%~10.6%。研究表明,超临界CO_2萃取全程分析时间小于1h,与常规溶剂法相比,该方法具有萃取效率高、无污染、经济等优点。     

反相高效液相梯度洗脱法测定药材中雷公藤甲素的含量

[目的]通过高效液相色谱法建立测定雷公藤甲素含量的方法,控制药材质量,为保证临床用药的有效性和安全性提供依据。[方法]采用反相高效液相层析（RP-HPLC）梯度洗脱法建立雷公藤药材中雷公藤甲素的定量方法。采用AgilentC18柱（2.1mm×150mm,3μm）;乙腈-水二元梯度洗脱,0～8min（10：90～25：75,V：V）,8～33min（25：75～35：65,V：V）,33～40min（35：65～95：5,V：V）,40～48min（95：5,V：V）,48～55min（10：90,V：V）;流速：1.0ml/min;检测波长：220nm。[结果]采用RP-HPLC梯度洗脱法不仅快速有效地实现了药材中雷公藤甲素的良好分离,而且能够有效防止分析过程中的拖尾现象,较准确地测定雷公藤甲素的含量。雷公藤甲素的线性范围为25～2000μg/ml（r=0.9999）,该方法回收率为97.48%（RSD=1.55%）。[结论]该方法灵敏度高,准确可靠,重现性好,结果稳定。     

雷公藤甲素SD大鼠睾丸毒性体外试验研究

 探讨雷公藤甲素（Triptolide, TL）对体外原代培养SD大鼠睾丸支持细胞（sertoli cell）和生精细胞（spermatogenic cells）增殖的影响及其广谱钙粘附蛋白（Pan-cadherin）的表达。MTT法检测雷公藤甲素8种不同浓度（0,0.1,1,10,1.0×10²,1.0×10³,1.0×10⁴,1.0×10⁵ μg／L）对SD大鼠睾丸原代培养细胞增殖的影响;免疫细胞化学方法探讨在雷公藤甲素对单纯培养支持细胞的最小有毒浓度（0.1,1,10,1.0×10² μg／L）水平,培养细胞 pan -cadherin 的表达。结果表明：雷公藤甲素浓度≥10 μg／L时对混合培养细胞（主要为生精细胞）,≥1.0×10³ μg/L时对单纯培养支持细胞的增殖有明显抑制作用,均呈剂量依赖性。细胞半数抑制浓度（IC₅₀）分别为1.22 mg／L和28.15 mg／L。与溶剂对照组相比混合培养细胞在雷公藤甲素低浓度时（0.1和1 μg／L ）表达上调。雷公藤甲素低浓度即可抑制生精细胞增殖,而高浓度才能抑制支持细胞增殖,其细胞毒耐受性二者差异很大。睾丸毒性产生的原因可能与生精细胞的pan-cadherin表达上调有关。     

新型杀鼠剂的引进、应用势在必行

鼠害发生日趋严重,杀鼠剂种类繁多。化学杀鼠剂的长期使用,使鼠类产生了拒食性和抗药性。通过分析鼠类的生物特性和急性杀鼠剂、抗凝血杀鼠剂、生物杀鼠剂及植物源不育杀鼠剂雷公藤甲素的应用现状,提出了在大理州引进、应用和推广新型杀鼠剂的必要性。     

雷公藤甲素防治农牧交错区达乌尔黄鼠试验效果

2019年4月,在河北省康保县的天然草场,采用大区试验不设重复的方法,开展了雷公藤甲素防治农牧交错区达乌尔黄鼠防治试验,结果显示,每有效鼠洞分别投放0.25%mg/kg雷公藤甲素颗粒剂,饵料25 g、50 g,可有效防控农牧交错区达乌尔黄鼠,且具有适口性好、防治效果佳的优点。     

两种不育剂防治高原鼢鼠试验初探

利用0.2%莪术醇成品饵剂和0.25mg/kg雷公藤甲素颗粒剂2种鼠用不育剂在林间饱和投放高原鼢鼠有效洞道,通过高原鼢鼠对2种药剂的适口性取食及取食后抗生育情况进行了研究,结果表明2种药剂均对高原鼢鼠有很好的适口性,抗生育效果显著,0.25mg/kg雷公藤甲素颗粒剂比0.2%莪术醇成品饵剂适口性更好,防治效果更佳。     

HPLC法测定昆明山海棠蜜中雷公藤甲素的含量

 昆明山海棠蜜经萃取洗脱后，采用反相C¹⁸柱，以乙腈-水（30∶70）为流动相，以218 nm为检测波长，检测昆明山海棠蜜中雷公藤甲素的含量。结果：雷公藤甲素在1～20 μg/g范围内线性良好，r为0.999 9，平均回收率为103.06%（n=5），RSD为1.71%。     

雷公藤细胞的固定化研究

利用海藻酸钠凝胶包埋法构建了雷公藤细胞固定化培养体系,研究了固定化细胞的生长及雷公藤甲素合成的变化情况。结果表明,固定化细胞经历了缓慢、指数及稳定3个生长阶段;固定化细胞培养液总糖、可溶性蛋白及丙二醛的含量随着培养时间增加而逐渐减少;pH值则呈现先上升后下降的变化趋势;而细胞活力却呈现先下降后上升的趋势;培养过程中过氧化物酶活性的变化呈现"V"字型;超氧化物歧化酶活性变化不大;苯丙氨酸解氨酶活性先上升而后缓慢下降;雷公藤甲素的合成具有较好的同增效应,细胞内外的甲素含量都在培养的第15天达到了最大值。     

植物灭鼠剂对东方田鼠毒杀的有效性分析

为了测定植物灭鼠剂对东方田鼠毒杀的效果,在洞庭湖区捕捉东方田鼠,采用强制饲喂法对不同性别东方田鼠进行0.025%植物灭鼠剂(植物槲皮素+雷公藤甲素等)的毒性试验,观测分析东方田鼠取食和死亡情况,并比较灭鼠剂在东方田鼠性别间的毒性差异。结果表明：东方田鼠对植物灭鼠剂摄入量随天数增加有下降趋势,但不显著;不同性别东方田鼠对植物灭鼠剂的敏感性无显著差异。东方田鼠取食植物灭鼠剂后,死亡高峰期出现在第4～7 d。因此,0.025%植物灭鼠剂可有效防治洞庭湖区的东方田鼠鼠害,且东方田鼠对植物灭鼠剂无抗性。     

不同产地雷公藤中4种有效成分的含量测定

[目的]建立同时测定雷公藤中4种有效成分含量的方法,并研究不同产地雷公藤中4种有效成分的含量差异。[方法]采用Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;以乙腈-0.1%磷酸-0.2%三乙胺溶液为流动相,梯度洗脱;检测波长:0～65 min为225 nm,65 min后为210 nm;流速0.75 mL/min;柱温25℃;进样量10μL。[结果] 4种有效成分均有较好的分离度,方法精密度和重复性RSD均小于3.7%,待测样品于室温下24 h内能保持稳定,4种有效成分均有良好的线性关系,加样回收率分别为雷公藤甲素86.72%、雷公藤内酯酮107.51%、雷公藤红素76.94%、雷公藤酯甲84.38%。[结论]该方法精密度和重现性良好,可同时测定雷公藤中4种有效成分的含量,可为雷公藤的质量控制提供科学依据。     

雷公藤的GAP栽培技术

雷公藤为常用中药,以根入药,具祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒的功能。雷公藤也是植物源农药的极佳植物,把雷公藤开发为生物农药,可以用于无公害蔬菜、有机茶、无公害水果。在国内外,利用雷公藤植物研究新药已引起医药界的广泛重视,其应用领域正不断拓宽,需求量日渐增     

两种不同药剂饵料在荒漠林区防控鼠害效果分析

大沙鼠、子午沙鼠、三趾跳鼠是准噶尔盆地荒漠灌木梭梭林的主要危害生物,植株被害率上升率达11.45%。利用毒饵增效保护器投放克鼠星饵料和雷公藤甲素饵料,植株被害率下降率分别达到57.9%和57.8%;在自然灭洞率年度变化均值23%左右的情况下,克鼠星饵料防控区灭洞率年变化均值达到33%左右,雷公藤甲素饵料防控区灭洞率年变化均值为62%左右。利用药剂饵料防控荒漠鼠害,可在局部区域快速、持续、有效的降低害鼠密度和种群数量,减轻荒漠植被受侵害程度,其不足之处是投资投劳量大,一次防治需连续2~3a,防控效果才能达到最佳。