环氧树脂固定化环状芽孢杆菌糖氨基转移酶的研究

使用环氧树脂MC-150EP对来自环状芽孢杆菌的糖氨基转移酶BtrR进行固定化以制备光学纯β-井冈霉烯胺,在单因素试验的基础上,采用响应面试验进一步优化固定化工艺,得到最佳固定化条件:载体与蛋白质投放比例为21, pH值8.2,温度17℃,盐离子浓度460 mmol·L~(-1),固定化时间15 h,辅酶浓度0.2 mmol·L~(-1),由此制得的固定化酶比活力为20.6 U·g~(-1)(湿载体),酶活回收率为66.5%。酶学性质研究表明,固定化酶的立体选择性与游离酶相同,最适反应温度和pH值分别为39℃和8.5,热稳定性和酸碱稳定性与游离酶相比有较大提高;同时,固定化酶具有良好的操作稳定性和储存稳定性,在连续使用9个批次后,固定化酶保留初始酶活的50.5%; 4℃下连续放置20 d后,固定化酶的比活力为初始酶活的81.6%。     

Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶发酵培养基优化及酶学性质研究

为了提高木质素降解子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶的能力,采用响应面分析法优化其产酶培养基。最优的发酵培养基组成为:麸皮30 g·L~(-1),可溶性淀粉58.08 g·L~(-1),牛肉浸膏3.39 g·L~(-1),NaNO_3 1 g·L~(-1),KH_2PO_4 3 g·L~(-1),CuSO_4 0.554 g·L~(-1)。采用该优化培养基,GHJ-4菌株的漆酶酶活达到410.04 U·m L~(-1),比优化前提高9.5倍。以愈创木酚为底物,该菌株纯化漆酶的最适反应温度为50°C,最适反应pH为5.0,米氏常数Km为62.07μmol·L~(-1),最大反应速度Vmax为68.97 mmol·(L·min)-1;该漆酶在55°C以下、pH3.5~6.5的范围内较为稳定,Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)对漆酶酶活有明显促进作用,而Hg~(2+)、Fe3+、Ag+对漆酶酶活有显著抑制作用。结果表明,Paraconiothyrium variabile GHJ-4是一株高效的漆酶产生菌株,具有潜在的工业化应用前景。     

芽孢杆菌L4菌株角蛋白酶的酶学性质研究

采用室内实验方法,对芽胞杆菌L_4菌株产生的角蛋白酶进行了系列的酶学性质研究.结果表明,以角蛋白溶液为底物时该酶的最适酶促反应温度为40℃,最适酶促反应pH为7.0,其Km值为1.88 mmol·L~(-1),Vmax为2.72×10~(-2)mmol·L~(-1)·s~(-1).利用不同的蛋白酶抑制剂进行酶活性抑制实验,发现该酶受邻啡罗啉和EDTA的抑制,推测该酶可能是一种含Zn~(2+)的金属蛋白酶.微量元素对该酶活力的影响显著,Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶活力有促进作用,高浓度的Fe~(2+)和Cu~(2+)明显抑制角蛋白活力.     

捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L~(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1) MgCl_2,60μmol·L~(-1)CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L~(-1)的反应体系(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1)MgCl_2,60μmol·L~(-1) CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9%,并实现重组子pET-22b-Hc-daf-22在E.coli BL21体内进行表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示,pET-22b-Hc-daf-22基因在大肠杆菌中成功表达,呈部分可溶性,融合蛋白的分子量约为59 k D,测得蛋白浓度为1.70μg·μL~(-1);针对该表达产物的酶活分析结果表明,原核表达的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性,其最适反应pH为8.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为33.765μmol·L~(-1)和1 784 nmol·L~(-1)·min~(-1)。【结论】捻转血矛线虫DAF-22是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一,本试验通过体外酶活试验成功测定Hc-DAF-22蛋白的酶活性,证明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)同源蛋白相比硫解酶活性较低。     

丝瓜多酚氧化酶及过氧化物酶酶学特性的研究

应用分光光度法研究丝瓜多酚氧化酶及过氧化物酶酶学特性的影响因素,为丝瓜酶促褐变的研究提供基础。以普通丝瓜果肉为材料,PPO以邻苯二酚为底物,POD以愈创木酚为底物,研究分析反应温度、反应时间、pH及测量波长、底物的浓度、PPO提取酶液添加量对丝瓜PPO、POD活性的影响。丝瓜褐变相关酶提取和测定方法的优化:(1)PPO最佳反应体系:测定波长408nm、反应温度是35℃、pH为6.0、酶液用量0.15mL,最适底物为邻苯二酚,底物浓度为0.056mol·L~(-1);(2)POD最佳反应体系:测定波长410nm,反应温度为40℃,最佳pH为5.5,酶液用量0.1mL,底物是愈创木酚,浓度为0.067mol·L~(-1)。     

辣根过氧化物酶催化氧化17β-雌二醇的研究

[目的]优化辣根过氧化物酶（HRP）催化氧化17β-雌二醇（E2）的体系。[方法]研究反应体系pH值、反应温度、H2O2浓度、反应时间、HRP浓度和E2初始浓度对E2去除效果的影响。[结果]HRP能有效催化H2O2氧化水体中的E2。HRP酶催化氧化E2的适宜条件是：pH值为6.5,反应温度25℃,H2O2与E2摩尔反应计量比（MH2O2∶ME2）为1∶2。增大HRP和E2起始反应浓度,以及适度增加H2O2用量,反应速度会明显加快,但过量的H2O2会抑制HRP的催化活性,减小E2去除率。在[E2]初始=0.07342mmol/L,[HRP]=0.07342U/ml,pH值为6.5,反应温度为25℃和MH2O2∶ME2=1∶2条件下,反应60min,E2去除率达到94.8%。[结论]该研究可为提高H2O2氧化水体中E2的去除率提供科学依据。     

用辣根过氧化物酶催化降解海水中柴油污染的研究

为深入探索酶催化技术在海洋石油污染处理中的应用,以游离辣根过氧化物酶(HRP)催化降解海水中柴油污染,研究了酶用量、溶液p H值、柴油初始浓度和催化反应时间等因素对酶催化降解海水中柴油污染的影响,确定了HRP催化降解海水中柴油污染的优化工艺条件,同时考察了反应助剂对海水中柴油污染去除率的影响。结果表明:HRP能有效催化降解海水的柴油污染,当海水中柴油的质量浓度为1.2g/L时,在温度为25℃、HRP加入量为1.6 U/m L、H_2O_2为250 mg/L、溶液pH为5的条件下,催化降解3 h,柴油去除率可达90.77%;聚乙二醇(PEG)对HRP催化降解海水中的柴油污染有较显著的影响。     

玉米中β-D-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究

为了研究玉米植株中β-D-葡萄糖苷酶测定的最佳条件,建立快速准确的β-D-葡萄糖苷酶活性的检测方法。本试验以玉米品种泰玉11号为研究材料,研究了以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物,分光光度比色法测定玉米叶中β-D-葡萄糖苷酶活性的反应条件(包括缓冲液pH值、底物浓度、测定波长、反应温度和时间)。结果表明,当反应温度为40℃、反应时间为40 min、缓冲液pH值4.8、反应底物pNPG的浓度为10 mmol·L~(-1)、测定波长为402 nm时,β-D-葡萄糖苷酶的活力最大。     

基于介孔碳修饰玻碳电极的邻苯二酚电化学检测

利用涂布法制备了介孔碳修饰玻碳电极。通过循环伏安法和差分脉冲伏安法对邻苯二酚进行了电化学测验。实验结果表明:该修饰电极对邻苯二酚的氧化还原反应有良好的电化学催化作用,响应峰电流与裸电极峰电流相比增大近8倍。在最佳实验条件下,邻苯二酚的催化氧化峰电流在浓度为1.0~80.0μmol·L~(-1)时与浓度呈良好的线性关系,检出限为0.24μmol·L~(-1),并且可以在对苯二酚共存时选择性测定邻苯二酚。     

木质素胺在稀酸水溶液中的聚集行为

为研究木质素胺在稀酸水溶液中的聚集行为,采用表面张力仪、紫外分光光度仪、激光纳米粒度分析仪等方法测定了木质素胺在稀酸水溶液中的表面张力、吸光度、粒径和Zeta电位,探讨了无机盐及pH值对其聚集行为的影响。结果表明:木质素胺溶液的临界聚集质量浓度(CAC)为0.10 g·L~(-1)。当质量浓度低于CAC时,木质素胺主要以单分子形式存在;当质量浓度大于CAC时,木质素胺主要以多分子聚集体的状态存在。木质素胺的Zeta电位随质量浓度升高先快速增加到最大值37.6 m V,随后略有降低。木质素胺呈现出一定的表面活性,在10.00 g·L~(-1)时的表面张力为44.09 m N·m~(-1)。在木质素胺溶液中加无机盐后,表面张力升高,Zeta电位降低,稳定性下降,容易聚集形成更大的颗粒而发生沉淀。p H值对木质素胺溶液聚集行为的影响与无机盐的变化趋势一致。     

凤尾菇(Pleurotus sajor-caju)漆酶Lac4基因在黑曲霉中表达研究

研究将凤尾菇漆酶基因Lac4(Gene Bank登录号AJ507327.1)cDNA克隆到表达载体pSZHG10-6-2上,通过农杆菌介导法导入黑曲霉CICC2462中,筛选得到糖化酶基因glaA位点发生同源重组的黑曲霉转化子。摇瓶发酵后取上清液作SDS-PAGE检测、酶活测定及酶学性质和酶稳定性分析,研究重组漆酶对染料脱色影响。结果表明,成功分泌表达重组漆酶r Lac4,其活性在第9天时达酶活最高峰1 211 U·L~(-1);酶学性质研究发现,其最适反应温度为60℃、pH为4.5,且在10~30℃及pH 5.0~6.0稳定性较好。最适反应条件下,重组漆酶对ABTS的Km为0.142 mmol·L~(-1),最大反应速率Vm为0.693 mmol·L~(-1)·min~(-1)·mg~(-1);通过重组漆酶研究4大类染料脱色能力,发现ABTS为介体时该漆酶对三苯基甲烷类孔雀绿脱色可达44%,杂环类中性红、偶氮类甲基橙脱色率分别13%和11%,而对蒽醌类活性亮蓝(RBBR)降解作用不明显,重组漆酶对孔雀绿的脱色效率具有较大应用价值潜力,对含三苯基甲烷染料废水处理应用前景良好。     

苯甲酰矢车菊素-3-葡萄糖苷的酶法合成及结构表征

采用响应面分析确定脂肪酶催化合成酰基化矢车菊素-3-葡萄糖苷的最佳工艺,并通过液质联用和核磁共振对产物进行鉴定。结果显示,以酰基化反应转化率为指标的最佳工艺条件为:反应温度41℃,真空度-90 kPa,酶浓度43 mg·m L~(-1),矢车菊素-3-葡萄糖苷浓度10 mg·mL~(-1),苯甲酸甲酯浓度0.4 g·mL~(-1),反应时间24h,最终转化率为90.92%。矢车菊素-3-葡萄糖苷的酰基化产物经液质联用和核磁共振鉴定为矢车菊素-3-(6-苯甲酰)葡萄糖苷。     

狗头枣过氧化物酶特性研究

研究狗头枣过氧化物酶(POD)的催化特性及抑制剂和激活剂对其活性的影响。结果表明:以愈创木酚为底物时,狗头枣POD最适pH 6.5~7.5左右,最适温度40℃,最适底物浓度0.1mol·L~(-1);抑制剂浓度0~21mol·L~(-1)时,抑制强弱顺序为抗坏血酸L-半胱氨酸EDTA,当抗坏血酸浓度21 mmol·L~(-1)时,狗头枣POD残存酶活为12.8%,狗头枣POD活性随三氯化铁和硫酸铜浓度的升高而增加,三氯化铁的激活效果明显高于硫酸铜;当温度高于55℃时,热处理对狗头枣POD的钝化效果较显著;55℃处理30 min,POD残存活力68.2%;80℃处理25 min、85℃处理20 min或90℃处理10 min可以完全钝化狗头枣POD。     

活性炭催化臭氧化降解亚甲基蓝实验

研究了活性炭催化臭氧化降解模拟染料废水亚甲基蓝溶液,考察了臭氧化空气流量、pH值、废水初始质量浓度和活性炭用量等因素对处理效果的影响。结果表明：该法可有效去除有机物,废水在低质量浓度、碱性条件下对反应有利;在亚甲基蓝初始质量浓度100mg·L^-1,pH9.5,活性炭9g·L^-1,反应90min条件下,色度去除率达到了95.6%,化学需氧量（COD）去除率达到了64.8%;活性炭催化臭氧化废水以间接氧化为主,活性炭可促进臭氧化过程产生·OH自由基并提高其利用率,相对于单独臭氧化过程,废水COD去除率可显著提高。     

基于响应曲面法优化贵州木霉NJAU4742产胞外木聚糖酶的研究

[目的]本研究旨在通过响应曲面法优化生物肥功能菌贵州木霉NJAU4742液体发酵过程中产胞外木聚糖酶的参数,为生产木霉固体菌种及其生物有机肥提供理论依据。[方法]采用单因子试验,获得不同单因子对菌株产胞外木聚糖的影响;利用Minitab 15.0软件设计Plackett-Burman试验并对试验结果进行分析,选出核心因子;再利用响应曲面法(response surface methodology)设计Box-Behnken试验完成核心因子的优化,并结合Design Expert 10.0软件分析试验数据,最终得出菌株产木聚糖酶的最佳条件;在最佳条件下,利用凝胶电泳分析胞外蛋白条带差异并测定蛋白含量。[结果]单因子试验结果表明:尿素与氯化钙含量、培养基初始pH值、温度、培养时间对菌株产木聚糖酶影响比较大,尿素和氯化钙最佳含量分别为0.25 g·L~(-1)、0.40 g·L~(-1),最佳初始pH值3.0、培养温度28℃、培养时间7 d。响应曲面优化试验确定尿素添加量、氯化钙添加量、初始pH值和磷酸二氢钾添加量为影响菌株产胞外木聚糖酶的核心因子,并确定液体发酵主要参数:尿素0.29 g·L~(-1)、氯化钙0.35 g·L~(-1)、磷酸二氢钾2.12 g·L~(-1)、初始pH值3.16、培养温度28℃、培养时间7 d、孢子接种量1.0×10~5CFU·mL~(-1)。凝胶电泳结果表明,发酵条件优化后部分区域蛋白含量明显增加。[结论]发酵过程参数优化后贵州木霉NJAU4742产胞外木聚糖酶活性达到19.86 U·mL~(-1),比没有优化前提高1.25倍,菌株胞外蛋白含量比原始培养条件培养提高1.50倍。     

常温偏酸条件下耐铜酵母的筛选及驯化

为提高动物对铜元素的吸收效率,减少粪便铜含量,降低污染及增加生物发酵料的铜营养价值,寻找能够应用于常温偏酸条件下进行生物发酵的富铜酵母菌。本试验从啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)、产朊假丝酵母(Candid autilis)、面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)三类酵母菌中选取6株菌株进行耐铜酵母的筛选,并将筛选出的耐铜酵母,模拟南方生物发酵的温度及pH值,以逐步提高培养基初始铜浓度的方式进行驯化。结果表明,啤酒酵母的耐铜性能最佳,其最佳的铜起始驯化浓度为100 mg·L~(-1),经过反复驯化,其最终获得的耐铜浓度为600 mg·L~(-1),经筛选耐铜啤酒酵母最适生长的铜浓度为200 mg·L~(-1),在温度为28～30℃,pH值(6.2±0.2)条件下获得的耐铜酵母风干菌体铜含量为14.97 g·kg~(-1)。啤酒酵母经过驯化,在常温及偏酸的条件下,能够获得高的耐铜特性。     

紫外光照和Fe(Ⅲ)存在下苯酚氧化与Cr(Ⅵ)还原的协同作用

研究了紫外光照下Fe(Ⅲ)为光催化剂促进苯酚(C6H5OH)与Cr(Ⅵ)氧化还原反应作用机制及其影响因素。结果表明:200μmol·L-1Fe(Ⅲ)存在下初始浓度为200μmol·L-1苯酚的氧化速率和初始浓度为200μmol·L-1Cr(Ⅵ)的还原速率均得到明显提高,平均速率分别为3.4和4.0μmol·L-1·min-1,均比无Fe(Ⅲ)时的速率提高了1倍;降低溶液pH值有利于反应速率的增加,但温度的变化对反应速率影响不显著。增加初始Fe(Ⅲ)和苯酚浓度,同样能有效提高Cr(Ⅵ)的还原速率。Cr(Ⅵ)还原和苯酚的氧化均符合一级反应动力学规律。     

超声活化过硫酸盐氧化降解水溶液中的全氟辛烷磺酸盐

针对全氟辛烷磺酸盐(PFOS)去除,构建了超声活化过硫酸盐氧化体系。考察了体系中超声频率、过硫酸盐浓度、溶液初始pH值和空化气体等因素对PFOS降解速率的影响,并对PFOS降解过程产生的自由基及其降解中间产物进行了捕捉和鉴定。结果表明:在30℃、pH值7.0、过硫酸盐浓度0.93 mmol·L~(-1)、超声频率400 kHz、功率100 W和超声密度2.67 W·cm-2条件下,18.58μmol·L~(-1)的PFOS经过8 h反应,降解率达到99.5%。超声活化过硫酸盐体系表现出显著的协同效应,PFOS降解速率比单独超声和单独过硫酸盐体系降解速率之和提高4.77倍,其表观准一级反应动力学常数在实验范围内随超声频率增加而增大,随过硫酸盐浓度增加先增后减,随溶液初始pH值增加而减小,四种空化气体中以氩气的降解效果为最佳;电子自旋捕捉试验表明,硫酸根自由基和羟基自由基参与了PFOS的降解。根据超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)分析得到的七种降解产物,给出了PFOS在该体系中可能的降解途径。     

脱甲河流域水体溶解有机碳时空分布特征

以亚热带脱甲河农业小流域为研究对象,利用高温催化氧化法和顶空平衡-气相色谱法对脱甲河水系4级河段(S1、S2、S3和S4)溶解有机碳(DOC)浓度与环境因子进行了1年周期(2014年12月至2015年11月)的连续观测,并初步探讨了DOC浓度与环境因子间的相关关系。结果表明:脱甲河DOC浓度范围在0.46~9.54 mg·L~(-1)之间,均值为3.09±0.01 mg·L~(-1);在季节变化上,DOC浓度表现为夏季春季冬季秋季;在空间分布上各级河段DOC浓度随河流级别的增加逐渐增大,变化范围为(1.36±0.07)~(4.25±0.21)mg·L~(-1),4级河段间DOC浓度出现了显著差异(P0.01),表明外源输入可能是不同河段DOC浓度变异的主要原因;DOC浓度与河水溶存二氧化碳(CO_2)浓度、盐度、温度、溶解总固体(TDS)及电导率(EC)呈极显著正相关(P0.01),与溶解氧(DO)呈显著负相关(P0.05),而与pH值变化无显著关系。研究表明,不同强度的水体理化性质及外源输入是造成DOC浓度差异的主要原因,研究结果可供亚热带其他农业小流域水系DOC浓度时空分布及影响因素研究参考。     

环丙沙星在盐碱土中吸附特性的研究

采用OECD guideline 106批平衡吸附法研究环丙沙星在碱土中的等温吸附特性、吸附动力学、吸附热力学以及pH值和Ca~(2+)浓度对其吸附的影响。结果表明环丙沙星在盐碱土中的吸附较好地符合Freundlich方程(拟合系数R~2=0.981),不同初始浓度的环丙沙星在盐碱土中的吸附过程符合准二级动力学方程,吸附常数为1.17×10~(-3)~5.67×10~(-3)kg·min~(-1)·m L~(-1)。吸附过程可分为快速吸附和慢速平衡两个阶段,初始浓度分别为80、100、120 mg·L~(-1)的环丙沙星吸附平衡时间为24 h,平衡吸附比例分别为89.9%、92.2%、92.7%。吸附热力学参数ΔG0且ΔH=-3.58 5 k J·mol~(-1),表明环丙沙星在盐碱土上的吸附为自发的放热反应。随着溶液pH值的升高,盐碱土对环丙沙星的吸附能力不断减弱,当pH9后吸附能力快速减少。以不同浓度CaCl_2作为背景液,环丙沙星在盐碱土中的等温吸附曲线用Freundlich方程拟合效果较好,lgKf值随着CaCl_2背景溶液浓度的增加而减小,且环丙沙星初始浓度较小时其所受离子强度的影响相对较小。