沉默囊泡分选蛋白(VPS)对辣椒疫霉效应因子RxLR504功能的影响

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要的病原卵菌,能产生大量的RxLR效应分子帮助病原菌定殖。前期实验证明RxLR504效应分子能够抑制INF1引发的细胞死亡,并证实囊泡分选蛋白(VPS)与其相互作用。本文借助VIGS tool在线工具设计靶标基因沉默片段;利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟靶标基因;提取沉默样品叶片组织RNA,构建c DNA文库;利用qRT-PCR检测靶标基因表达水平;在沉默植株叶片上表达RxLR504,24 h后接种INF1,观察病斑症状。结果表明:本氏烟中设计沉默片段长度为300 bp,构建c DNA文库质量较高;荧光定量PCR结果显示,沉默植株中靶标基因表达水平下降86.2%,与对照相比差异性显著;接种实验证明RxLR504在沉默植株与对照植株上均能抑制INF1引发的细胞死亡。RxLR504与VPS互作不影响其抑制INF1引起的细胞坏死,为进一步揭示病原物利用植物靶标基因抑制植物免疫从而促进自身寄生的机制打下基础。     

瞬时沉默乙醛脱氢酶对辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能的影响

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)产生的效应因子RxLR129113在本氏烟上的功能之一是抑制BAX引起的细胞坏死,而且已经证实乙醛脱氢酶(ALDH)是RxLR129113的互作蛋白。为了探究乙醛脱氢酶(ALDH)是否影响Rx LR129113抑制BAX引起的细胞坏死,本研究利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术,克隆了乙醛脱氢酶(ALDH)基因片段,插入到烟草脆裂病毒载体(TRV)中,构建了pTRV-ALDH的VIGS载体,转入农杆菌侵染本氏烟后qrt-PCR验证成功沉默了ALDH基因。在沉默ALDH基因的本氏烟上瞬时表达RxLR129113,24 h接种BAX。结果表明,在NbALDH沉默植株上,RxLR129113仍然抑制BAX引起的细胞坏死。本研究结果表明RxLR129113与ALDH互作不影响其抑制BAX引起的细胞坏死,为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能机制研究奠定了基础。     

辣椒疫霉效应分子RxLR19781与其互作蛋白的酵母互作一对一验证

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是毁灭性土传病害,短期内暴发成灾,该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌分泌大量的胞内效应分子,即RxLR效应分子,能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能,在病原卵菌侵染寄主及与寄主植物互作过程发挥着重要的作用。酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)系统是研究蛋白质相互作用最常用的方法,它既可以在cDNA文库中筛选互作的未知靶标蛋白,同时还可以验证两个目的蛋白之间的互作关系。本研究分别以辣椒疫霉c DNA基因组,辣椒cDNA基因组为模板,克隆了辣椒疫霉效应因子Rx LR19781以及其疑似互作蛋白泛素连接酶E2 10和辣椒脂质转移蛋白EARLI 1,并将它们分别成功构建到PGBKT7和PGADT7载体上。运用酵母共转化技术,将带有AD载体的互作蛋白和带有BD载体的效应因子共同转化到酵母感受态Y2HGold中,对它们是否存在互作关系进行了深入研究。结果表明,两个疑似互作蛋白都与效应因子RxLR19781互作。但由于酵母双杂交存在一定的假阳性,因此该效应分子与互作蛋白的互作有待进一步深入的研究。     

辣椒疫霉RxLR19781效应分子原核表达纯化及晶体生长条件的研选

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)侵染寄主细胞常分泌Rx LR效应蛋白分子,效应蛋白对寄主细胞具干扰或破坏作用。为了深入开展辣椒疫霉Rx LR效应蛋白分子功能特性机制的研究,本文利用PCR技术分离鉴定了辣椒疫霉效应分子Rx LR19781,以质粒p ET28a(+)为表达载体、大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主,利用IPTG诱导Rx LR19781蛋白表达,通过亲和层析、离子交换层析及分子筛层析纯化获得高纯度蛋白,借助坐滴法培养优化获得Rx LR19781蛋白晶体,X射线衍射获得2.76?的蛋白晶体数据,以便解析Rx LR19781蛋白三级结构,有助立足Rx LR19781蛋白三级结构探索效应分子Rx LR19781功能机制特性,为构建新型病害防控策略和培育持久抗病辣椒品种提供理论研究。     

辣椒疫霉效应因子RxLR101012的表达纯化与结晶初探

植物病原卵菌会分泌一系列的效应分子进入寄主体内,从而促进病原菌的侵染。这些效应分子或在质外体积累或进入宿主细胞内来调控寄主的免疫反应。但效应分子如何逃避寄主的免疫识别,使植物发病的分子机制目前还不清楚。本研究从辣椒疫霉强致病性菌株SD33中克隆分离获得1个效应分子Rx LR101012,利用相关生物信息学软件分析了该效应分子的基因序列,并对其进行了原核表达与纯化,确定了该基因高效表达条件,利用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,获得Rx LR101012高纯度蛋白,得到Rx LR101012蛋白晶体,为后续解析Rx LR效应分子蛋白三维结构,从结构生物学角度探知Rx LR效应分子生理生化功能奠定了基础。     

辣椒疫霉效应因子RxLR115890不同侵染时期的差异性表达

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)能够产生370多个RxLR效应分子,绝大多数效应分子的特性都是未知的。为了对辣椒疫霉RxLR效应因子开展深入的功能研究,本研究以辣椒疫霉SD33菌株的DNA为模板,设计辣椒疫霉菌以及RxLR115890的特异性引物。采用实时荧光定量PCR检测RxLR115890在辣椒疫霉游动孢子侵染条件下,不同时间的表达量。结果显示,RxLR115890的表达量在侵染前期有明显的上调表达,伴随着侵染时间的加长表达量迅速下降,又在12 h处再次轻微上调。由此得出结论,RxLR115890对辣椒疫霉菌的前期侵染具有至关重要的作用。为RxLR115890后续的研奠定了基础。     

辣椒疫霉效应分子RxLR22034的表达纯化及晶体生长

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)作为一种重要的植物病原卵菌,侵染寄主植物时能够分泌RxLR效应分子,从而激活或抑制植物的防卫反应,引起植物病害的产生。为了深入研究辣椒疫霉效应分子与植物互作的机制及致病机理,本文从辣椒疫霉菌株SD33中克隆得到了RxLR22034效应分子,以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主,进行了原核表达与纯化,确定了该基因高效表达条件。通过亲和层析及分子筛层析纯化获得高纯度蛋白,借助坐滴法培养优化获得RxLR22034蛋白晶体,X射线衍射获得2.7?的蛋白晶体数据,为后续解析RxLR效应分子蛋白三维结构,从结构生物学角度探知辣椒疫霉RxLR效应分子生理生化功能奠定了基础。     

肉桂醛对辣椒疫霉的抑制作用

为了探讨肉桂醛对辣椒疫霉的抑制机制,研究了肉桂醛作用下辣椒疫霉菌丝的径向生长、辣椒疫霉孢子的萌发与活力、辣椒疫霉孢子内活性氧(ROS)含量和NADPH氧化酶基因(nox)的表达以及外援ROS清除剂谷胱甘肽(GSH)存在下肉桂醛对辣椒疫霉孢子生长的影响。结果显示:肉桂醛能够有效地抑制辣椒疫霉菌丝的径向生长和孢子的萌发,抑制辣椒疫霉菌丝径向生长的EC50值为1.0 mmol/L,完全抑制辣椒疫霉孢子萌发的MIC值为0.4 mmol/L,并且Almar blue染色发现此时辣椒疫霉孢子几乎没有活力;0.4 mmol/L肉桂醛处理辣椒疫霉孢子0.50h时,孢子内ROS含量明显增加;GSH能够明显缓解肉桂醛对辣椒疫霉孢子的抑制作用;0.4 mmol/L肉桂醛处理辣椒疫霉孢子0.25 h,孢子内nox1基因表达上调,表明肉桂醛可能是通过上调nox1基因的表达从而产生大量的抑制辣椒疫霉的ROS。     

不同培养基对辣椒疫霉致病力的影响

辣椒疫霉的菌落形态、生长速率、产生孢子囊的能力、致病力的强弱与培养基种类有很大关系。其中在燕麦片培养基上生长最快 ,致病力也最强 ,但致病力的强弱与菌丝生长速率没有关系 ;菌株在同一培养基 (营养条件 )下生活一定时间后 ,其致病力强弱发生了分化 ,认为营养条件是影响辣椒疫霉致病力分化的因素之一     

寄主诱导的基因沉默对辣椒疫霉菌的影响

由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是生产中最严重的病害之一。本研究利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术,通过瞬时表达疫霉菌基因沉默信号,在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)-疫霉菌互作系统中建立寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)体系,为防治辣椒疫病提供新思路。首先,在TRV2-GFP和对照TRV2-GUS的本氏烟叶片上接种表达GFP的致病疫霉菌菌株14-3-GFP,结果显示TRV2-GFP植株中致病疫霉菌的GFP表达显著降低,表明利用VIGS技术构建的HIGS体系在本氏烟草—疫霉菌体系中可行。此外,选取辣椒疫霉菌致病相关基因 PcAvh1、 Pchmp1和 PcGK4,构建到TRV2载体上,通过在本氏烟草中表达结合接种辣椒疫霉菌,结果显示,与对照相比植物生长表型无明显变化,表达TRV2- PcGK4的植株对辣椒疫霉菌表现抗病,表达TRV2- PcAvh1和TRV2- Pchmp1的植株对辣椒疫霉菌的抗感性没有显著影响,表明 PcGK4可能是辣椒疫霉菌致病必须的基因之一。以上结果表明,利用HIGS技术沉默辣椒疫霉菌 PcGK4基因可有效降低辣椒疫霉菌对寄主的侵染,HIGS技术可用于辣椒疫霉菌致病关键基因的筛选和鉴定。     

辣椒疫霉中一个具有转录因子序列特征的外泌蛋白的分析鉴定

植物病原细菌分泌核调控蛋白进入寄主细胞核调控其基因表达以利于自身的侵染,但目前对卵菌中该类蛋白知之甚少.前期生物信息学分析从辣椒疫霉中获得一个具有DNA结合域的外泌蛋白PcSEP9,利用qRT-PCR检测其在辣椒疫霉侵染前期(菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢萌发)和侵染阶段[灌根接种本氏烟(Nicotiana ben...     

木霉生物育苗基质中功能菌数量对辣椒促生效应的影响

[目的]本文旨在研究含不同木霉菌数量的生物育苗基质对辣椒种苗生长及其移栽后辣椒单株果实重的影响,揭示生物育苗基质中功能菌数量与作物促生效应的相关关系。[方法]采用室内育苗及田间试验研究含不同数量级木霉菌的生物育苗基质对辣椒种苗生物量、壮苗指数以及种苗移栽后辣椒株高、茎粗、单株果实重及根际木霉菌数量的影响。[结果]两季辣椒育苗试验结果均表明,与不含木霉菌的普通育苗基质对照(SCK)相比,含10~7 CFU·g~(-1)木霉生物育苗基质处理(S4)种苗的地上部干重均显著增加42.9%和75.0%,而含10~7 CFU·g~(-1)(S4)、10~6 CFU·g~(-1)(S3)及10~5 CFU·g~(-1)(S2)的木霉生物育苗基质处理壮苗指数第1季显著增加61.4%、40.4%和15.8%;第2季显著增加66.7%、50.0%和18.8%。与普通育苗基质培育的辣椒种苗移栽田间对照(CK)相比,含10~7和10~6 CFU·g~(-1)木霉菌生物育苗基质培育的辣椒种苗移栽田间处理(T4、T3)的辣椒根际土壤木霉数量均显著增加,两季平均增加8.1%和5.4%;含10~7、10~6和10~5 CFU·g~(-1)木霉菌生物育苗基质培育的辣椒种苗移栽田间处理(T4、T3、T2)的辣椒单株果实重均显著增加,两季平均增加61.2%、39.6%和21.4%。皮尔逊相关性分析结果表明,基质中木霉数量与辣椒种苗地上部干重、移栽后辣椒单株果实重及根际土木霉数量之间呈极显著正相关关系。[结论]木霉生物育苗基质中功能菌数量大于10~5 CFU·g~(-1)对辣椒育苗及其移栽后的生长具有显著促进作用,并且促生增产效应随功能菌添加量的增加而增强。     

辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶活性对其致病力的影响

[目的]研究安徽省辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)的致病力与多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的关系.[方法]采用平板法定性检测辣椒疫霉产生的果胶酶活性,并对不同致病力菌株的PG活性的变化进行分析.[结果]辣椒疫霉均可产生果胶酶,形成水解圈.供试菌株接种辣椒苗复壮后的PG活性高于复壮前;强致病力菌株的PG活性明显高于弱致病力菌株;供试菌株的PG活性均在培养后第7天达到峰值.[结论]PG活性的高低与辣椒疫霉菌致病力的强弱相关,是该菌的致病相关酶.     

辣椒疫霉对甲霜灵和霜脲氰抗药性遗传的研究

为了探寻综合治理辣椒疫霉抗药性的有效途径,采用Ｎ－甲基－Ｎ’－硝基－亚硝基胍诱变方法,从辣椒游动孢子群体中筛选出２９株抗甲霜灵、６株抗霜脲氰的突变菌株,并证明突变菌株的抗药性经无性和有性生殖均可稳定遗传。     

辣椒疫霉交配型及其与对辣椒致病力的关系初步研究

采用单孢菌落直接配对法对来自安徽合肥、淮南、和县、潜山、岳西等县市的发病辣椒上分离鉴定获得22个辣椒疫霉菌株进行交配型测定,并采用离体叶片接种法测定了辣椒疫霉不同菌株的致病力。结果表明,安徽省辣椒疫霉菌存在A1和A2两种交配型,以A2占优势,均有分布,发生频率达81.8%。不同来源菌株对2个辣椒品种的致病力存在显著差异,各菌株对艳阳离体叶的平均病级范围为1.0～4.8,对合丰天瑞离体叶的平均病级范围为1.5～4.5。不同地区的菌株致病力有强弱之分,同一地区中不同菌株的致病力也存在一定的差异性。辣椒疫霉菌的致病力与品种之间存在互作关系,菌株的交配型与致病力无明显的相关性。     

应用嫁接技术增强辣椒对疫霉病的抗病性

以FKJ-1为砧木,以新椒3号和新椒10号为接穗,研究了用嫁接技术增强辣椒对疫霉病抗病性的田间效果.结果表明,嫁接苗可有效抵抗疫霉病的发生,采收期延长,产量明显增加.     

应用嫁接技术增强辣椒对疫霉病的抗病性

以FKJ-1为砧木,以新椒3号和新椒10号为接穗,研究了用嫁接技术增强辣椒对疫霉病抗病性的田间效果。结果表明,嫁接苗可有效抵抗疫霉病的发生,采收期延长,产量明显增加。     

大豆品种(系)对疫霉根腐病抗性研究

选择当地主栽的大豆育种材料103份，在室内盆栽后接菌进行抗性鉴定，结果表明：20份材料表现为抗病，占供试材料的19.43%；中度抗病的材料12份，占供试材料的11.65%，感病材料有71份，占供试材料的68.90%。     

鸡用(HI)抗体对免疫效应的影响

几年来．养鸡业迅速发展．特别是鸡对新城疫疫苗免疫达到什么程度有待于研究．下面来探试一下： 1材料与方法 1．1试验鸡 来于北票市畜牧局种畜场2007年5月30日出壳的海兰褐鸡雏，共320只，指派专人单独饲养，饲养条件同正常鸡群一样。     

旋毛虫胶质瘤致病相关蛋白1样蛋白2对宿主免疫功能的影响

[目的]本文旨在分析旋毛虫胶质瘤致病相关蛋白1样蛋白2(GLIPR1L2)对宿主免疫功能的影响。[方法]用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆旋毛虫GLIPR1L2基因,构建表达载体,获得重组蛋白(rGLIPR1L2),用Western blot分析rGLIPR1L2的反应原性。将大鼠外周血单核细胞(PBMC)与rGLIPR1L2共孵育,用免疫荧光检测技术(IFA)检测rGLIPR1L2与大鼠PBMC的结合,分析rGLIPR1L2对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。大鼠腹腔注射rGLIPR1L2后,测定血清中IL-4、IL-9、IL-17、TGF-β、IFN-γ等细胞因子的变化。背部皮下多点注射对小鼠进行免疫后,ELISA检测特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体的变化,收集旋毛虫成虫和肌肉幼虫并计数,分析rGLIPR1L2的免疫保护作用。[结果]体外试验表明,rGLIPR1L2能够促进大鼠PBMC的增殖与迁移,增强细胞NO分泌和吞噬功能,一定浓度下可提高细胞凋亡比例。体内试验显示rGLIPR1L2能促进大鼠IL-4分泌,但对细胞因子IFN-γ、IL-9、IL-17和...