沉默氧增强蛋白(OEE2)对辣椒疫霉效应因子RxLR19781的免疫功能影响

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种寄生范围广且能够产生大量RxLR效应因子来参与侵染寄主的病原卵菌。资料表明目前对多数辣椒疫霉RxLR效应因子在植物体内如何行使功能积累较少。本研究从辣椒疫霉菌中分离鉴定1个效应分子RxLR19781,为了初步明确RxLR19781的功能特性,本研究借助于烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus,TRV)介导的基因沉默技术,将RxLR19781的互作蛋白基因NbOEE2在本氏烟中瞬时沉默,通过qRT-PCR验证得到NbOEE2沉默植株,在沉默后的本氏烟植株中接种RxLR19781并验证该RxLR效应因子的功能。结果表明,在NbOEE2沉默植株上,RxLR19781不抑制辣椒疫霉游动孢子侵染。本研究结果表明OEE2可有效调控RxLR19781的功能特性,为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR19781功能机制研究奠定了基础。     

沉默囊泡分选蛋白(VPS)对辣椒疫霉效应因子RxLR504功能的影响

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要的病原卵菌,能产生大量的RxLR效应分子帮助病原菌定殖。前期实验证明RxLR504效应分子能够抑制INF1引发的细胞死亡,并证实囊泡分选蛋白(VPS)与其相互作用。本文借助VIGS tool在线工具设计靶标基因沉默片段;利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟靶标基因;提取沉默样品叶片组织RNA,构建c DNA文库;利用qRT-PCR检测靶标基因表达水平;在沉默植株叶片上表达RxLR504,24 h后接种INF1,观察病斑症状。结果表明:本氏烟中设计沉默片段长度为300 bp,构建c DNA文库质量较高;荧光定量PCR结果显示,沉默植株中靶标基因表达水平下降86.2%,与对照相比差异性显著;接种实验证明RxLR504在沉默植株与对照植株上均能抑制INF1引发的细胞死亡。RxLR504与VPS互作不影响其抑制INF1引起的细胞坏死,为进一步揭示病原物利用植物靶标基因抑制植物免疫从而促进自身寄生的机制打下基础。     

本氏烟NbHSP90基因的克隆及初步功能分析

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)通过与植物互作调节植物的免疫反应,进而引起植物感病.前期实验证明辣椒疫霉效应分子RxLR19781与本氏烟(Nicotiana benthamiana)热激蛋白90(NbHSP90)可以发生相互作用.利用RT-PCR技术从本氏烟中克隆得到基因NbHSP90,通过农杆...     

寄主诱导的基因沉默对辣椒疫霉菌的影响

由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是生产中最严重的病害之一。本研究利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术,通过瞬时表达疫霉菌基因沉默信号,在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)-疫霉菌互作系统中建立寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)体系,为防治辣椒疫病提供新思路。首先,在TRV2-GFP和对照TRV2-GUS的本氏烟叶片上接种表达GFP的致病疫霉菌菌株14-3-GFP,结果显示TRV2-GFP植株中致病疫霉菌的GFP表达显著降低,表明利用VIGS技术构建的HIGS体系在本氏烟草—疫霉菌体系中可行。此外,选取辣椒疫霉菌致病相关基因 PcAvh1、 Pchmp1和 PcGK4,构建到TRV2载体上,通过在本氏烟草中表达结合接种辣椒疫霉菌,结果显示,与对照相比植物生长表型无明显变化,表达TRV2- PcGK4的植株对辣椒疫霉菌表现抗病,表达TRV2- PcAvh1和TRV2- Pchmp1的植株对辣椒疫霉菌的抗感性没有显著影响,表明 PcGK4可能是辣椒疫霉菌致病必须的基因之一。以上结果表明,利用HIGS技术沉默辣椒疫霉菌 PcGK4基因可有效降低辣椒疫霉菌对寄主的侵染,HIGS技术可用于辣椒疫霉菌致病关键基因的筛选和鉴定。     

辣椒疫霉效应分子RxLR22034的表达纯化及晶体生长

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)作为一种重要的植物病原卵菌,侵染寄主植物时能够分泌RxLR效应分子,从而激活或抑制植物的防卫反应,引起植物病害的产生。为了深入研究辣椒疫霉效应分子与植物互作的机制及致病机理,本文从辣椒疫霉菌株SD33中克隆得到了RxLR22034效应分子,以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主,进行了原核表达与纯化,确定了该基因高效表达条件。通过亲和层析及分子筛层析纯化获得高纯度蛋白,借助坐滴法培养优化获得RxLR22034蛋白晶体,X射线衍射获得2.7?的蛋白晶体数据,为后续解析RxLR效应分子蛋白三维结构,从结构生物学角度探知辣椒疫霉RxLR效应分子生理生化功能奠定了基础。     

基于VIGS技术干扰病毒RNA防控烟草黄瓜花叶病毒病

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)引起的花叶病是烟草上的重要病害。本试验通过病毒诱导基因沉默技术(virus induced gene silencing, VIGS)构建靶向沉默CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP和CMV-CP的VIGS载体,测定基因沉默后CMV相对表达量、CMV病毒浓度和TRV相对表达量,并对VIGS载体对CMV的防治效果进行评价。结果表明,试验建立的VIGS载体能够有效导入烟株;沉默CMV-2a的处理CMV相对表达量最低,基因沉默效率最高,为46.25%;接种病毒30 d后CMV-2a处理的病毒浓度最低,仅为对照的72.8%,TRV载体的相对表达量显著高于其他处理;沉默CMV-2a的处理发病时间推迟,病情指数最低,防治效果最好。本研究建立的CMV-2a VIGS体系能够有效沉默外源侵入的CMV基因表达,抑制CMV在烟株内的传播,为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法。     

辣椒疫霉效应分子RxLR19781与其互作蛋白的酵母互作一对一验证

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是毁灭性土传病害,短期内暴发成灾,该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌分泌大量的胞内效应分子,即RxLR效应分子,能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能,在病原卵菌侵染寄主及与寄主植物互作过程发挥着重要的作用。酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)系统是研究蛋白质相互作用最常用的方法,它既可以在cDNA文库中筛选互作的未知靶标蛋白,同时还可以验证两个目的蛋白之间的互作关系。本研究分别以辣椒疫霉c DNA基因组,辣椒cDNA基因组为模板,克隆了辣椒疫霉效应因子Rx LR19781以及其疑似互作蛋白泛素连接酶E2 10和辣椒脂质转移蛋白EARLI 1,并将它们分别成功构建到PGBKT7和PGADT7载体上。运用酵母共转化技术,将带有AD载体的互作蛋白和带有BD载体的效应因子共同转化到酵母感受态Y2HGold中,对它们是否存在互作关系进行了深入研究。结果表明,两个疑似互作蛋白都与效应因子RxLR19781互作。但由于酵母双杂交存在一定的假阳性,因此该效应分子与互作蛋白的互作有待进一步深入的研究。     

利用病毒诱导的基因沉默技术沉默TSWV的NSm基因

【目的】番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)在全球范围内严重危害农业生产,病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术主要用于植物内源基因的功能研究,而其沉默植物外源病毒基因用于病毒防控鲜有报道。本研究利用VIGS技术在辣椒中沉默植物外源病毒TSWV的NSm基因,为辣椒产业防控TSWV病害奠定技术基础。【方法】以辣椒(Capsicum annuum L.)为研究材料,首先构建辣椒PDS基因的沉默载体pTRV2-PDS以评估该沉默载体在辣椒中的有效性,再构建TSWV NSm基因的沉默载体pTRV2-NSm评估该沉默载体对TSWV NSm基因的沉默效果。【结果】构建的沉默载体pTRV2-PDS在辣椒中有效,沉默载体pTRV2-NSm可以高效沉默TSWV的NSm基因,NSm的表达量仅为对照组的4.6%,且表现出对TSWV的抗性。【结论】构建的沉默载体pTRV2-NSm可以沉默TSWV的NSm基因,并使辣椒对TSWV产生一定的抗性。     

本氏烟组蛋白H4与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染

以番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus, ToMMV)外壳蛋白(Coat protein, CP)为研究对象,通过荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay, LCI)研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示,ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中,组蛋白H4定位于细胞核中,两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明,烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术沉默本氏烟烟草中的H4基因,对沉默H4基因的植株接种ToMMV,接种后第4 d,通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量,发现病毒含量显著低于对照组,结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制,组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细...     

辣椒疫霉效应因子RxLR115890不同侵染时期的差异性表达

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)能够产生370多个RxLR效应分子,绝大多数效应分子的特性都是未知的。为了对辣椒疫霉RxLR效应因子开展深入的功能研究,本研究以辣椒疫霉SD33菌株的DNA为模板,设计辣椒疫霉菌以及RxLR115890的特异性引物。采用实时荧光定量PCR检测RxLR115890在辣椒疫霉游动孢子侵染条件下,不同时间的表达量。结果显示,RxLR115890的表达量在侵染前期有明显的上调表达,伴随着侵染时间的加长表达量迅速下降,又在12 h处再次轻微上调。由此得出结论,RxLR115890对辣椒疫霉菌的前期侵染具有至关重要的作用。为RxLR115890后续的研奠定了基础。     

辣椒上TRV介导的番茄斑萎病毒N基因沉默体系构建及鉴定

【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。【方法】以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。【结果】湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明:pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。【结论】本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。     

适于烟草脆裂病毒诱导的本氏烟基因沉默分析的对照载体构建(英文)

对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默分析体系中目前最常用的对照载体——空pYL156载体(pYL156∷00)对沉默处理后番茄和本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株的病毒症状和生长影响进行分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的番茄和本氏烟植株均表现出严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,因此,pYL156∷00并不是一个用于TRV诱导的番茄和本氏烟基因沉默分析的好的对照载体;为获得更好的对照载体,试验构建了2个新的对照载体pYL156∷NIRi和pYL156∷eGFP,它们分别通过在pYL156∷00载体多克隆位点插入253bp菜豆亚硝酸还原酶基因内含子序列和400bp eGFP基因片段而获得,对这2个对照载体对沉默处理后本氏烟植株的病毒症状和生长情况的影响与pYL156∷00进行比较分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的植株表现出较严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,其中26.7%植株死亡;pYL156∷NIRi沉默处理后的植株也表现出明显的病毒症状以及生长受抑制现象,但与pYL156∷00相比,所受影响较小,只有13.3%植株死亡;而pYL156∷eGFP沉默处理后的植株不表现明显的病毒症状,植株生长也不受显著影响;病毒积累量检测结果显示,3个对照载体沉默处理的植株病毒症状和生长受抑制情况与植株体内TRV病毒的积累水平密切相关.这些结果表明,新构建的pYL156∷eGFP可以作为一个优越的对照载体应用于TRV诱导的基因沉默分析.     

黄瓜花叶病毒基因沉默载体的效率和稳定性分析

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)已被广泛应用于植物基因的功能研究。试验以八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)作为指示基因,在本生烟体内分析黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)作为VIGS载体对植物内源PDS mRNA的沉默效率。采用分子克隆的方法,将FnyCMV 2b ORF替换为不同长度的PDS序列,并分析了其在本生烟植物上诱导的PDS沉默效率。结果表明,该重组病毒能诱导上部系统叶的光漂白表型,且沉默效率与插入片段长度呈一定的正相关性,但在顶端新生叶中均不引起明显的光漂白现象,过长的片段插入(≥518 nt)影响病毒基因组的遗传稳定性,导致插入片段的部分缺失。CMV作为VIGS载体,最适合的插入片段约为350 nt。     

不同VIGS体系在棉花中沉默效率的研究

【目的】比较不同病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在棉花中的沉默效率。【方法】本研究以35S启动子驱动的抗卡那霉素基因nptⅡ为目标基因,利用RNA病毒载体TRV和DNA病毒载体CLCrV构建基因沉默载体,研究这2套VIGS体系在棉花中的基因沉默效率和沉默持续时间的差异。【结果】TRV体系比CLCrV体系沉默效率高,TRV体系比CLCrV体系沉默持续时间短,CLCrV体系能够在棉花蕾、花、花药等生殖器官中发挥沉默作用。【结论】TRV病毒沉默体系主要适用于短期的棉花内源基因的沉默,CLCrV病毒沉默体系适用于研究棉花生长发育后期生殖生长相关的基因功能。本研究为棉花选取合适的VIGS体系提供参考,对研究棉花基因功能具有重要意义。     

TRV介导的E3泛素连接酶基因NbE3R14沉默对烟草基础免疫及南方根结线虫寄生的影响

[目的]本文旨在研究E3泛素连接酶基因的沉默对植物基础免疫及线虫寄生的影响,为揭示植物寄生线虫侵染寄主的分子机制提供理论依据。[方法]利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟E3泛素连接酶基因NbE3R14,用flg22处理基因沉默烟草叶片,RT-qPCR检测PTI(病原相关分子模式触发免疫,PAMPs-triggered immunity)相关基因的表达水平;接种辣椒疫霉于基因沉默烟草叶片,观察叶片病斑症状;采用室内人工接种法测定靶基因的沉默对南方根结线虫寄生的影响。[结果]RT-qPCR检测显示:农杆菌转化的烟草植株中NbE3R14基因已被成功沉默,flg22处理基因沉默烟草叶片激发的PTI相关基因GRAS2、WRKY7及WRKY8表达量分别下降41.3%、63.9%及61.8%,与野生型对照(WT)相比均有显著性差异(P0.05);接种辣椒疫霉36 h后,TRV∷NbE3R14处理烟草叶片的病斑比WT增大28.5%;南方根结线虫在TRV∷NbE3R14处理植株上产生的根结数、雌虫数及卵块数与WT相比分别显著增加22.1%、27.4%和17.2%(P0.05),单卵块卵量则没有差异;而在TRV∷GFP处理植株上产生的根结数、雌虫数、卵块数以及单卵块卵量与WT均无明显差异。[结论]沉默NbE3R14基因能干扰植物基础免疫,从而导致烟草对辣椒疫霉及南方根结线虫的侵染更为感病。     

基于小麦品种‘洛夫林10’的VIGS体系研究

为将病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技术应用于小麦-叶锈菌互作体系及小麦基因功能研究,本试验在优化适宜BSMV繁殖并引起发病的环境条件基础上,将病毒载体转染小麦品种‘洛夫林10’(简称L10)叶片并接种叶锈菌生理小种,发现接种病毒对叶锈菌侵染反应型没有影响,通过构建TaCAMTA4与TaATG8的BSMV-VIGS载体,将体外转录病毒转染小麦,以感染BSMV:PDS的L10作指示,在指示叶片变白后,经半定量RT-PCR检测,发现目的基因的表达量明显降低,表明用VIGS技术能够成功沉默L10中的目的基因,这一结果为进一步研究小麦与叶锈菌互作过程中小麦基因的功能及分子机制奠定了基础。     

辣椒病毒诱导基因沉默接种方法的优化

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,简称VIGS)技术在候选基因功能验证方面起着非常重要的作用。以辣椒八氢番茄红素脱氢酶基因(简称PDS)为目标基因,分析表达载体转化农杆菌的菌液在LB液体培养基和诱导培养基(IM)中D600 nm值的变化趋势。结果表明,当LB液体培养基中菌液D600 nm值为1.15时,后续利用IM培养菌液的效率最高,PDS基因沉默效果明显;优化了农杆菌接种方法,可为辣椒利用VIGS技术进行候选基因的功能验证提供参考。     

棉花VIGS病毒载体的构建及其在抗病基因功能鉴定的应用

【目的】利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术,研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【方法】利用分子生物学技术构建VIGS病毒载体,建立VIGS病毒诱导沉默体系;利用此体系将棉花中的一个钙依赖蛋白(CDPK)基因,通过农杆菌介导在陆地棉中沉默,根据此基因沉默植株在病原菌环境下的发病情况研究该基因在棉花抗病中的功能。【结果】利用包含有GhCPK抗病基因片段的VIGS病毒载体的农杆菌侵染棉花子叶,病毒载体上的目的基因片段由RNA聚合酶识别并合成双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),dsRNA由Dicer酶识别并于其它RNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC),RISC对内源GhCPK mRNA进行识别和切割作用,内源GhCPK mRNA降解而发生基因沉默。GhCPK基因沉默导致棉苗对黄萎病敏感性增加,证明GhCPK基因参与调控棉花抗病功能。【结论】病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够快速有效的研究GhCPKs基因在棉花抗病中的功能。     

病毒诱导的基因沉默

    "病毒诱导的基因沉默"(virus-induced gene silencing,VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的"恢复"现象,是一种植物抗病毒侵染的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术,用于基因功能分析VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)驱动,siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)结合后,特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合,并降解RNA模板已有源于15种不同类型病毒的VIGS载体得到开发和应用在VIGS栽体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究     

烟草丛顶病毒编码的沉默抑制子初步鉴定

 烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）为幽影病毒属成员,能在烟草上造成严重危害。TBTV基因组编码4个ORF,其中ORF3和ORF4几乎完全重叠,可能在TBTV的致病性中发挥重要作用。分别将TBTV的ORF3和ORF4与载体pGR107连接,构建植物表达载体pGR107 ORF3,pGR107 ORF4。经农杆菌与含外源GFP基因的pGREEN208共浸润转GFP基因的本氏烟16c叶片,2～5d后（days post inoculation,dpi)在紫外灯下观察发现浸润区有明显绿色荧光,其中pGR107 ORF4在12dpi后浸润区绿色荧光区域扩大,推断ORF4编码产物可能具有局部抑制本氏烟16c对外源GFP基因进行沉默的功能;而pGR107 ORF3浸润区绿色荧光逐渐恢复红色,GFP基因发生沉默,说明ORF3编码产物不具有抑制基因沉默的功能。进一步利用real time PCR定量检测发现,pGR107 ORF4浸润15 dpi 的本氏烟叶片中GFP RNA的含量要比仅接种pGR107的对照高,比未接种的本氏烟16c稍低。推断是因为ORF4编码蛋白抑制了植物对外源GFP RNA产生的沉默,使GFP得以在本氏烟内表达。由此进一步证实ORF4编码产物是TBTV的基因沉默抑制子。