人TroponinⅠ的表达载体构建诱导表达和纯化及活性测定

以人肝脏cDNA文库为模板，通过PCR方法扩增出Troponin基因，将其克隆到pCR-TOPO质粒中，构建表达质粒pET-22b（＋）-TnⅠ，转化大肠杆菌BL21（DE3）-RPX并进行诱导表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的20％以上并主要以可溶形式存在。建立了TroponinⅠ的非亲和色谱纯化工艺，纯化后蛋白产量约为20mg／L．纯度在90％以上。体外活性实验表明重组蛋白具有良好的抗血管生成。     

人Troponin I的表达载体构建诱导表达和纯化及活性测定

以人肝脏Cdna文库为模板,通过PCR方法扩增出Troponin基因,将其克隆到Pcr-TOPO质粒中,构建表达质粒Pet-22 b(+)-TnI,转化大肠杆菌BL 21(DE 3)-RPX并进行诱导表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的20%以上并主要以可溶形式存在.建立了Troponin I的非亲和色谱纯化工艺,纯化后蛋白产量约为20 mg/L,纯度在90%以上.体外活性实验表明重组蛋白具有良好的抗血管生成.     

OjCHS原核表达载体的构建及重组蛋白的纯化

查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,也是限速酶,它直接影响并限制类黄酮的合成与积累。在克隆得到日本蛇根草CHS基因（OjCHS）基础上,将该基因插入原核表达载体pET-28a,完成重组表达质粒pET28a-CHS的构建。随后,利用冻融法将上述质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中用于重组蛋白的表达。选择不同IPTG 浓度、诱导温度及诱导时间对重组菌进行诱导,确定了可溶性重组蛋白的最佳诱导表达条件。最后,通过洗脱、纯化、透析与浓缩完成重组蛋白的纯化。结果显示,成功构建原核表达载体pET28a-CHS,可溶性重组蛋白最佳诱导条件为：IPTG 浓度0.45 mmol·L^-1,25 ℃下诱导12 h。最后大量制备并纯化获得符合预期大小的可溶性蛋白,为深入研究OjCHS的生物学功能奠定了基础。     

人肥胖基因大肠杆菌表达载体的构建及其诱导表达

通过设计1对PCR引物（上游引物,5-′GCCATATGGTGCCGATCCAAAAAG-3′,下游引物,5-′GAGAATTCCCTTCAAGGCCTCAG-3′）,采用PCR方法扩增出人肥胖基因编码成熟肽的核苷酸序列,将扩增产物从琼脂糖凝胶上回收后插入测序载体pMD-18-T后进行了核苷酸序列测定。将经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的扩增产物插入经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的大肠杆菌表达载体pET-28a（＋）,构建了可在大肠杆菌中高效表达人瘦蛋白的表达载体。将表达载体转化入大肠杆菌菌株BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果表明构建的人肥胖基因表达载体得到高效表达,重组蛋白占到菌体总蛋白的31.2%。     

HCV NS5B蛋白表达、纯化及活性测定

以HCV cDNA为模板,设计特异性扩增引物,PCR得到编码NS5B的基因,与PET-21a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta菌株,加入IPTG(终浓度0.5 mmol/L),30℃、5 h诱导表达。连续通过Ni-NTA柱、SP阳离子交换柱纯化蛋白,1 L菌液可得到1.2 mg蛋白。体外活性测定结果表明,所得蛋白具有RdRp功能,酶对底物UTP的Km值为2.06μmol/L。     

蚊虫乙酰胆碱酯酶的真核表达、纯化及活性测定

利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯度较高的乙酰胆碱酯酶。参照Ellman法对酶的活性进行测定,结果显示纯酶的活力为2.219×10-4 mol/(min.g)。     

水稻HL-CMS中线粒体基因orf216原核表达载体构建及蛋白纯化

将orf216基因克隆到含有组氨酸标签的原核表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒pET-30a(+)-orf216,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys菌株感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。通过Ni-NTA亲和层析系统纯化获得高纯度目的蛋白。研究结果表明,成功构建了pET-30a(+)-orf216原核表达载体并转化大肠杆菌。SDS-PAGE和Western Blot结果显示30 ku处有单一条带,确定其能高效表达并且诱导表达产物为ORF216蛋白。同时对利用Ni-NTA层析系统纯化高纯度高含量ORF216融合蛋白的条件进行了优化。     

交替氧化酶的原核表达、纯化及活性研究

利用原核表达系统BL21和FN102表达交替氧化酶,用镍-NTA(Ni-NTA)琼脂糖凝胶层析柱纯化交替氧化酶可溶蛋白,利用SDS-PAGE检测纯化蛋白电泳纯度,用分光光度法测蛋白活性.结果表明:FN102表达的交替氧化酶量高于BL21;在BL21表达系统中的蛋白电泳纯度＜10％,而在FN102中表达的纯化蛋白电泳纯度达到90％～95％;BL21中表达交替氧化酶纯化蛋白活性为165.1 nmol/(min· mg),FN102中表达的交替氧化酶纯化蛋白活性为64.0 nmol/(min·mg).     

枯草杆菌ylyA基因表达载体的构建及诱导表达

ylyA是枯草杆菌的一种功能未知基因,本研究旨在建立YlyA的诱导表达体系,为其结构分析和功能研究奠定基础。PCR扩增ylyA序列,将其克隆到pETMCSIII中构建表达载体pNG252,测序分析无突变后用IPTG诱导6×His-YlyA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行分析。实验结果表明:pNG252中ylyA插入方向正确,序列无突变;新鲜的转化子培养至OD600为0.7左右时,用0.000 5 mol.L-1IPTG,37℃诱导3 h,YlyA高效表达。因此本研究成功构建了YlyA高效可诱导表达载体并建立了YlyA蛋白的诱导表达条件,所得到的6×His-YlyA融合蛋白,纯化后可用于YlyA晶体结构分析和功能研究。     

链球菌表面三磷酸甘油醛脱氢酶及其突变体重组蛋白的表达和纯化

表达并纯化M6型GAS表面三磷酸甘油醛脱氢酶以及其敲除C末端赖氨酸残基重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。克隆了M6型GAS ATCC32175的GAPDH基因以及GAPDHΔ345基因,与pASK-IBA37载体连接后,表达蛋白并用亲和层析色谱纯化重组蛋白;对重组蛋白进行质谱检测,并用酶切方法进一步纯化目的蛋白,通过酶促反应实验测定了重组蛋白的生物活性。2种基因克隆条件稳定,蛋白表达量大,酶切后纯度高,纯化的重组蛋白具有较高的生物活性。功表达并纯化了rGAPDH和rGAPDHΔ345蛋白。     

人视黄醇结合蛋白基因的毕赤酵母表达载体构建

用PCR方法从pGEX-hRBP中扩增人视黄醇结合蛋白(retinol bingding protein，prop)，用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9，然后用T4连接酶将目的片段克隆到pPIC9载体中。分别用PCR方法和酶切方法验证了此载体构建成功，为下一步使用毕赤酵母进行真核表达人视黄醇结合蛋白打下基础。     

动物乳腺特异表达载体的构建及其表达特性研究

为了研制动物乳腺生物反应器,用中国奶山羊β-乳球蛋白基因的5′、3′-侧翼区和β-酪蛋白基因的第1内含子构建动物乳腺特异表达载体p205C3.细胞表达试验结果显示,p205C3载体能够指导lacZ基因在SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞中表达,不能指导该基因在COS-1细胞和山羊成纤维细胞中表达.将人激肽释放酶(hKLK1) cDNA克隆入p205C3载体,用获得的重组载体p205C3KLK1注射哺乳期小鼠,然后取其心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、胰腺和乳汁,酶活性测定结果显示,乳汁中的酶活性高达255.65 U·mL-1,其他组织中的酶活性与正常小鼠无差异.结果表明p205C3载体不仅能有效地指导外源基因在山羊乳腺细胞和小鼠乳腺中表达,而且表达具有较好的组织特异性,可以用于动物乳腺生物反应器的研制.     

耐盐基因HAL1的克隆及植物表达载体的构建

对编码调节离子转运蛋白的基因HAL1进行克隆、序列测定,并对植物表达载体进行构建。基因测序分析表明：该基因含有885个核苷酸,与GenBank上公布的HAL1基因的核苷酸同源性为99.30%,氨基酸序列同源性为99.32%。利用HindⅢ和XbaⅠ切点插入质粒pBY505的Actin启动子与PIN终止子之间,构建成适宜于直接转化法转化植物的表达载体pBHAL1。     

基因打靶载体选择标记盒的构建及表达

为构建山羊乳腺基因打靶载体的选择标记盒,将loxP位点分别引入正、反向引物,以含新霉素磷酸转移酶(neo)基因的质粒pTarget为模板,用高保真聚合酶链反应(PCR)扩增得loxP neo loxP选择标记盒。将PCR产物克隆到pGEM T载体后进行的序列分析结果显示,引入的loxP位点及扩增后的neo基因序列均是正确的。将此选择标记盒克隆到不含neo基因的真核表达载体ΔpTarget后转染COS 1细胞,经过G418筛选获得药物抗性细胞克隆。再将此选择标记盒克隆到山羊β 乳球蛋白基因打靶载体并转染山羊成纤维细胞,经过G418选择后也获得抗性细胞克隆。结果表明:克隆的loxP neo loxP选择标记盒可用于基因打靶载体的构建。     

茶叶儿茶素提取和纯化研究

选用不同极性的溶剂，综合提取粗老绿茶中的粗脂类和粗儿茶素；用正交试验设计，优化各提取工艺参数，得到得率为２．３２％～２．４％的粗咖啡碱，２．６％～２．７％的脂溶性色素和得率为２３．８７％，含量为４７．５％，儿茶素相对提取率为８３．５％的粗儿茶素制品Ｉ。用活性碳对制品Ｉ进行纯化，得到得率为１５．０６％，儿茶素回收率为８６．９％，含量为６４．０％的儿茶制品Ⅱ，再用硅胶吸附纯化，得到儿茶素回收率为９０．     

人巨细胞病毒pp150抗原区基因片段的克隆与表达

为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗,根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物,利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段.序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100%.将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35 h的外源蛋白.表达产物免疫小鼠,所得抗体具有低滴度中和作用.     

重组质粒BT24的构建

用ＢａｍＨ Ｉ从植物表达载体ｐＢＨ１９中,酶切回收含３５Ｓ启动子与Ｎｏｓ终止子的胰蛋白酶抑制因子基因（ＨＲＴＩ）片段,将其克隆到植物表达载体ｐＴＨＹ４８的ＢａｍＨＩ位点,构具潮霉素选择标记的植物表达载体ｐＢＴ２４。经Ａｇｒｏｓｅ ｇｅｌ检测和酶切鉴定,获得具有胰蛋白酶抑制因子基因和潮霉素抗性基因的植物表达载体ｐＢＴ２４。     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因反义表达载体的构建

本实验用设计好的两条75bp的长引物进行PCR反应，扩增出甜瓜PGl基因的128bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体中，筛选反向克隆，然后将其反向构建到植物表达载体pUC38-ACC的CaMV35S启动手和TMV增强子“Ω”的下游，构建成反义表达载体pUC38-PGo用PCR鉴定重组子，并经序列分析证明获得含有反向插入PG基因片段的植物表达载体，为用花粉管法将其导入河套蜜瓜，培育转基因耐储河套蜜瓜奠定了基础。