西方蜜蜂工蜂不同虫态发育的转录组学分析

【目的】基于转录组学对西方蜜蜂工蜂不同虫态间的差异表达基因（DEGs）进行筛选和功能注释分析,揭示与工蜂生长发育相关的信号通路,为深入解析工蜂生长发育的分子调控机理提供基础数据。【方法】以西方蜜蜂工蜂的3日龄幼虫、1日龄蛹和1日龄羽化工蜂3个虫态为研究对象,利用llumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序,采用DESeq2筛选不同虫态样品间的表达差异基因,然后分别进行GO功能注释分析及KEGG信号通路富集分析,并通过实时荧光定量PCR进行验证。【结果】经转录组测序,在西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫与1日龄蛹间筛选出4823个差异表达基因（51.86%上调,48.14%下调）,在1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间筛选出3295个差异表达基因（57.51%上调,42.49%下调）,在3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间筛选出5267个差异表达基因（52.95%上调,47.05%下调）。GO功能注释分析结果显示,3日龄幼虫与1日龄蛹间的差异表达基因注释到43个GO功能条目,1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间的差异表达基因注释到45个GO功能条目,3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间的差异表达基因注释到44个GO功能条目,主要涉及细胞过程、细胞部分及结合等。KEGG信号通路富集分析发现,3日龄幼虫与1日龄蛹间有2905个差异表达基因富集到332条KEGG信号通路上,其中17条KEGG信号通路呈显著富集,涉及核糖体、氧化磷酸化和昆虫激素生物合成等;1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间有1644个差异表达基因富集到331条KEGG信号通路上,其中45条KEGG信号通路呈显著富集,涉及氧化磷酸化、生热作用和胰岛素分泌等;3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间有2958个差异表达基因富集到337条KEGG信号通路上,其中14条KEGG信号通路呈显著富集,涉及核糖体、蛋白酶体和胰岛素分泌等。6个随机挑选差异表达基因的实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果相符,即转录组测序结果可靠。【结论】昆虫激素生物合成通路相关差异表达基因调控与西方蜜蜂工蜂各虫态JH滴度变化规律一致,氧化磷酸化信号通路则与各虫态的营养摄入和活动行为相关,而胰岛素分泌通路涉及各虫态的营养调控、脂肪体合成及细胞凋亡。可见,昆虫激素生物合成、胰岛素分泌和氧化磷酸化3种信号通路在西方蜜蜂工蜂幼虫、蛹和成虫的发育调控中发挥着重要作用。     

鸡卵泡膜细胞中膜联蛋白A2互作细胞蛋白的筛选及其功能分析

【目的】从鸡卵泡膜细胞蛋白中筛选和鉴定与膜联蛋白A2（ANXA2）相互作用的细胞蛋白并进行功能分析,为深入研究ANXA2调控鸡卵泡发育的作用机制提供理论依据。【方法】制备开产后30周龄贵州黄鸡的卵泡膜细胞,提取卵泡膜总蛋白后利用His Pull-Down联合质谱技术（LC-MS/MS）从卵泡膜细胞中筛选出与鸡ANXA2互作的细胞蛋白,然后通过GO数据库和KEEG数据库分别进行GO功能富集分析及KEEG信号通路注释分析,并利用STRING Version 11.0绘制蛋白互作网络图。【结果】通过His Pull-Down联合LC-MS/MS共鉴定获得41个鸡ANXA2互作细胞蛋白,GO功能富集分析发现这些互作细胞蛋白在分子功能、生物学进程和细胞组成均发挥作用。其中,在分子功能方面主要涉及蛋白结合（占58.06%）、催化活性（占19.35%）、核糖体结构（占16.13%）及细胞骨架结构组成（占6.45%）,在生物学进程方面主要参与细胞骨架（占19.35%）、刺激反应（占19.35%）、翻译（占16.13%）、代谢过程（占12.90%）、细胞迁移（占12.90%）、蛋白折叠（占9.68%）和蛋白运输（占9.68%）,而细胞组分显示以定位于细胞膜的蛋白为主（占32.26%）。鸡ANXA2蛋白互作细胞蛋白参与的KEEG信号通路主要有应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫系统和蛋白定位等。鸡ANXA2互作细胞蛋白互作网络可分为3条,即CNN2-FN1-MYH9-MYH10-ACTN1-CSRP1、ANXA1-ANXA2-ENO1-PRDX4-GPI-ATP5B-PRDX3-HSPA8-TUBB2A和CCT7-CCT4-GNB2L1-ATP5A1-RPS3-RPS3A-RPL23A-RPL22-RPS7;互作细胞蛋白间存在复杂的互作关系,其中又以膜联蛋白A1（ANXA1）与烯醇化酶-1（ENO1）及ANXA2的互作关系最明显。【结论】鸡ANXA2互作细胞蛋白主要参与细胞骨架形成、应对刺激和翻译等生物学过程,涉及应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫及蛋白定位等信号通路。其中,PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC可能通过与ANXA2蛋白相互作用而参与鸡卵巢相关疾病的发生,而ANXA1与ANXA2相互作用可能在鸡卵泡的发育及排卵过程中发挥重要调节作用。     

鸡OATP1B3互作蛋白筛选及其相关基因的转录表达分析

【目的】筛选鉴定鸡有机阴离子转运多肽1B3(OATP1B3)的互作蛋白,并探究其对鸡蛋绿壳颜色形成的影响,为提高绿壳蛋鸡群体选育准确性提供参考依据。【方法】以真核表达载体p EGFP-SLCO1B3和空载体pEGFP-C1分别转染绿壳型赤水乌骨母鸡蛋壳腺上皮细胞,通过免疫共沉淀（Co-IP）结合液相色谱与串联质谱联用技术（LC-MS/MS）筛选鸡OATP1B3互作蛋白,经GO功能注释分析、KEGG信号通路富集分析及蛋白相互作用网络分析鉴定出与鸡蛋绿壳性状形成相关的OATP1B3互作蛋白。同时,通过构建SLCO1B3基因沉默及过表达载体分别转染蛋壳腺上皮细胞,检测SLCO1B3基因过表达或沉默时部分OATP1B3互作蛋白基因（FXR1、CTTN、RPL12和RPS17）在蛋壳腺上皮细胞中的表达情况,并根据鸡蛋壳颜色分为白壳、浅绿和深绿3种类型,分析蛋壳颜色△a*值与FXR1、CTTN、RPL12和RPS17基因表达的相关性。【结果】共筛选鉴定出37个与鸡OATP1B3相互作用的蛋白,其中FXR1、CTTN、RPL12和RPS17与鸡蛋的绿壳性状有密切关系。SLCO1B3基因过表达能极显著...     

小麦响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因筛选与鉴定

【目的】筛选鉴定小麦品种连麦12响应禾谷镰刀菌侵染过程中的核心基因,为小麦赤霉病防御分子网络提供理论参考。【方法】对成功感染禾谷镰刀菌的连麦12小穗进行转录组测序,通过DESeq筛选差异表达基因（DEGs）,对DEGs进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,构建DEGs的蛋白质互作网络,通过MCODE和cytoHubba筛选核心基因。【结果】对小麦品种连麦12接种禾谷镰刀菌（处理组）和接种无菌去离子水（对照,CK）72 h后的DEGs进行筛选,结果共筛选出14180个DEGs,其中有10966个DEGs上调表达,有3214个DEGs下调表达。经GO功能注释分成三大类,共51个条目,其中,细胞组分包含14个条目,主要富集在细胞、细胞部件和膜3个条目;分子功能包含11个条目,主要富集在催化活性和结合2个条目;生物学过程包含26个条目,主要富集在细胞过程、代谢过程和刺激反应3个条目。KEGG信号通路富集分析结果显示,富集到代谢、次级代谢物生物合成、苯丙烷类生物合成、植物信号激素转导、植物MAPK信号通路的DEGs数量最多;富集到光合作用—天线蛋白通路,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,谷...     

持续感染口蹄疫病毒VP1蛋白对细胞转录组的影响

【目的】通过转录组测序（RNA-Seq）方法分析持续感染口蹄疫病毒结构蛋白VP1诱导的PK-15细胞基因表达谱的变化,探索VP1蛋白对宿主细胞信号通路的影响。为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。【方法】PK-15细胞分别转染pCAGGS-HA（对照载体）、pCAGGS-HA-Pi-VP1质粒,转染36 h后,Western blot检测VP1蛋白表达,同时提取两组细胞总RNA进行转录组测序（每组3个重复,2组6个样本）。将测序所得的序列进行过滤比对,获得差异表达基因后,对差异表达基因进行了生物信息学分析。采用qRT-PCR验证关键差异表达基因的表达。【结果】RNA-Seq共鉴定出3 376个差异表达基因（DEGs）|log2(Fold Change)|>0和padj<0.05,其中上调基因1 744个,下调基因1 632个。许多参与免疫反应和炎症的效应基因差异表达。GO和KEGG富集分析显示,差异基因GO条目绝大部分与核糖体有关,而KEGG富集中涉及了与天然免疫相关的信号通路,如TNF信号通路、Toll受体信号通路。【结论】pCAGGS-...     

基于4D label-free技术的水稻成熟种子蛋白质组学研究

【目的】从蛋白水平揭示水稻种子成熟的分子基础，探究调控水稻种子成熟的关键蛋白和代谢通路。【方法】选用授粉后30 d的成熟水稻种子，利用4D label-free定量蛋白质组学进行质谱鉴定，通过生物信息学技术分析蛋白的亚细胞定位、结构域、GO注释和KEGG通路注释。【结果】总共鉴定了3 484个种子成熟期的蛋白，相对分子质量大多在10 000～100 000之间，主要分布于细胞质、细胞核、叶绿体、线粒体和质膜上；结构域主要涉及蛋白质翻译的RNA识别基序和蛋白磷酸化修饰的蛋白激酶结构域；GO分析表明，成熟种子的蛋白主要参与了细胞过程和代谢过程，主要涉及催化活性和结合等功能，大多分布在细胞、细胞组分、细胞器和细胞膜等部位；KEGG分析发现，蛋白主要富集在核糖体、内质网中的蛋白质加工、氧化磷酸化和糖酵解等途径，推测蛋白质的翻译、加工和能量代谢是水稻种子成熟期的主要分子事件；进一步鉴定了脱落酸(Abscisic acid,ABA)信号和吲哚乙酸(Indoleacetic acid,IAA)代谢的相关蛋白，同时也发现了NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)家族的转录因子。【结论】贮藏物质的积累...     

2种不同生长规格墨瑞鳕肌肉组织转录组测序分析

【目的】掌握不同生长规格墨瑞鳕个体间差异表达基因的表达特点,为其功能相关基因深度挖掘及分子遗传育种提供科学依据。【方法】挑选同一养殖条件下极大个体和极小个体的墨瑞鳕,构建肌肉组织cDNA文库后,采用Illumina HiSeqTM 4000测序平台对存在生长差异的墨瑞鳕肌肉组织进行转录组测序分析,获得的Unigenes在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO等数据库中进行比对;通过FPKM及DEGseq筛选出差异表达基因,以GOseq和KOBAS对差异表达基因分别进行GO功能注释及KEGG信号通路富集分析,并采用MISA进行SSR鉴定分析。【结果】从墨瑞鳕肌肉组织中共测序获得39749条Unigenes,其长度范围在301~55230 bp,平均长度为1705 bp。注释到Nt、Nr、Swiss-Prot、Pfam数据库的Unigenes分别有27046、20824、18268和17772条,在7个数据库中均得到注释的Unigenes共计6742条,占Unigenes总数的16.96%。根据差异表达基因筛选条件P<0.05且|log₂ Fold Change|>1,共筛选出722个差异表达基因,其中上调基因308个、下调基因414个。差异表达基因GO功能注释分析结果表明,注释基因数目较多的GO功能条目包括细胞过程、代谢过程、膜、细胞器及结合等;KEGG信号通路富集分析发现,差异表达基因被成功富集到234条信号通路上,主要涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信号通路、MAPK信号通路、胰岛素信号通路及FoxO信号通路等。在39749条Unigenes中鉴定筛选出22120个SSRs,占Unigene总数的55.65%,SSR的平均间距为3063 bp。【结论】基于转录组测序分析获得的墨瑞鳕肌肉组织差异表达基因以发挥结合、细胞过程及代谢过程等功能为主,且主要富集在PI3K-Akt信号通路、核糖体信号通路、FoxO信号通路及细胞凋亡等能量代谢相关通路上,通过共同协调而对墨瑞鳕的生长发育起调控作用。     

鸡腺苷琥珀酸裂解酶互作蛋白的筛选及其功能分析

通过探究鸡腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase)基因ADSL与其互作基因的调控关系,为进一步研究ADSL在肌肉中高表达的原因和ADSL影响肌肉风味的机制提供参考。本研究构建了鸡(gallus)ADSL基因的重组真核表达载体pEGFP-C1-ADSL,将pEGFP-C1-ADSL和pEGFP-C1质粒分别转染鸡成肌细胞,提取表达成功的细胞总蛋白,利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)联合质谱分析鉴定与鸡ADSL蛋白互作的细胞蛋白,并对结果进行GO功能注释、KEGG通路和蛋白互作网络分析。通过分析筛选出RPL4、PDLIM5、ACTG1和SRSF10蛋白,检测在ADSL基因过表达和沉默状态下,RPL4、PDLIM5、ACTG1和SRSF10基因在成肌细胞中的表达情况。结果表明,与ADSL互作的蛋白共94个;生物信息学分析表明,这些蛋白定位于细胞结构体、胞内和含蛋白质的复合物上,它们主要参与细胞进程、生物调节和刺激反应等生物进程。间接免疫荧光结果显示,重组蛋白pEGFP-C1-ADSL主要定位于细胞核和细胞质。ADSL过表达时,...     

长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1 重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2 重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO 培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。     

应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白

【目的】含有VQ基序（VQ）的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的“FxxhVQxhTG”氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交（Y2H）显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白（空GST为阴性对照）,利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B（RACK1B）,通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。     

猪PKM2基因在肺炎支原体感染3 D4/21细胞后的互作蛋白质鉴定与分析

通过构建含有HA标签的PKM2过表达质粒转染3D4/21细胞,利用免疫共沉淀(Co-IP)与液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术分析与鉴定猪PKM2基因在肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞3D4/21后的互作蛋白质,并对这些互作蛋白质进行GO与KEGG通路分析。结果显示肺炎支原体感染3D4/21细胞后,PKM2在mRNA水平和蛋白质水平上表达上调,其表达水平呈现剂量与时间依懒性。免疫共沉淀反应结果显示IP与IgG组共鉴定到72个蛋白质,这2组鉴定到的蛋白质数分别为60和19,其中7个蛋白质在2组中同时鉴定到。GO分析结果表明IP组的互作蛋白质主要参与了NAD代谢过程、NADH代谢过程、肌原纤维组装、NADH再生和葡萄糖代谢丙酮酸等生物过程,其中大多数与能量代谢有关。KEGG pathway分析结果表明互作蛋白质参与了致病性大肠杆菌感染、军团杆菌病、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和癌症中的中枢碳代谢等通路,这些通路与细菌感染和能量代谢有关。     

应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白

【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的"FxxhVQxhTG"氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的Bam HⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白(空GST为阴性对照),利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B(RACK1B),通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。     

基于TMT蛋白组学及生物信息学分析牦牛抗冻差异蛋白

【目的】从蛋白水平阐明牦牛抗寒性能机理,并进一步从营养学角度提高其代谢性能,为牦牛有效抵御外界恶劣气候条件提供科学依据。【方法】应用TMT蛋白组学技术对寒冷季节（1月）和温暖季节（8月）的牦牛抗冻蛋白进行挖掘,并对鉴定到的牦牛抗冻蛋白进行亚细胞定位、结构域、GO功能富集、KEGG信号通路注释、蛋白相互作用等生物信息学分析。【结果】从牦牛耳组织中共鉴定获得21856个肽段（Peptide）,其中特有肽段（Unique peptide）序列为18452个,定量获得4519个蛋白,最终筛选出144个差异蛋白,其中上调蛋白89个、下调蛋白55个。144个牦牛抗冻差异蛋白亚细胞定位到7个条目上,分别是细胞核蛋白56个、细胞质蛋白51个、质膜蛋白24个、细胞外蛋白23个、线粒体蛋白18个、细胞骨架蛋白1个和溶酶体蛋白1个;共鉴定到194个结构域。GO功能富集分析结果显示,生物过程主要富集到细胞过程蛋白79个、代谢过程蛋白70个和生物调控蛋白42个等,分子功能主要富集到结合功能蛋白75个和催化活性蛋白64个等,细胞组分主要富集到细胞部分蛋白89个和细胞蛋白89个等。144个牦牛抗冻差异蛋白在KEGG数据库中注释到205条KEGG信号通路,主要涉及核糖体、氮代谢、胞质DNA感受、动物体内生热作用、氧化磷酸化、白细胞介素-17及钙离子信号等通路。牦牛抗冻差异蛋白相互作用网络分析发现L8IHE5的关联度最高,且冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）和HSP70结合蛋白在蛋白相互作用网络中具有更多的相互作用关系。【结论】基于TMT蛋白组学对牦牛抗冻差异蛋白进行挖掘,结果鉴定获得144个抗冻差异蛋白（上调蛋白89个,下调蛋白55个）,其中CIRP和HSP70在冷应激条件下呈上调趋势,能促使牦牛肌体适应低温环境,可作为牦牛抗冻性育种的候选分子标记。     

牛优势卵泡颗粒细胞与膜细胞中生殖激素合成相关基因的筛选与分析

【目的】探究牛优势卵泡颗粒细胞(GCs)和膜细胞(TCs)中基因的表达差异,筛选并研究与生殖激素合成相关的基因。【方法】在GEO数据库获得GSE83524芯片数据,通过在线软件GEO2R筛选牛优势卵泡中GCs和TCs之间的差异表达基因。使用DAVID软件对获得的差异表达基因进行GO功能富集分析;使用KOBAS软件进行KEGG信号通路分析,筛选出GCs和TCs之间参与生殖激素合成相关信号通路;使用String结合Cytoscape软件构建蛋白与蛋白之间的相互作用网络(PPI)。以牛的优势卵泡为材料,采用Real-time PCR对筛选出的差异表达基因进行验证。【结果】经在线软件GEO2R分析,共获得247个差异表达基因,其中43个表达上调,204个表达下调;247个差异表达基因的GO功能分析结果共分为3大类41组,其中参与生物学过程(BP)的有22组,参与细胞组分(CC)的有12组,参与分子功能(MF)的有7组;KEGG信号通路分析共发现17条通路,其中腺苷酸环化酶3基因(ADCY3)、细胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)、腺苷酸环化酶8基因(ADCY8)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白基因(GNAS)、骨形态发生蛋白6基因(BMP6)5个差异表达基因参与了卵巢类固醇生成通路。经PPI网络互作分析,筛选出了前10位的Hub基因;Real-time PCR结果显示,CYP17A1、ADCY8在TCs中的表达量极显著高于GCs (P0.01);ADCY3、BMP6在TCs中的表达量显著高于GCs(P0.05),GNAS在GCs中的表达量极显著高于TCs(P0.01),这5个基因在GCs和TCs中的表达趋势与GEO芯片数据结果一致。【结论】ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6在GCs与TCs之间表达量存在显著差异,其可能在牛优势卵泡GCs和TCs中对生殖激素的合成及分泌产生了重要作用。     

中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38 μmol•L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和3.46 μmol•L-1。分子对接显示AcerASP2具有1个呈狭长的口袋状的疏水性结合内腔,4-烯丙基藜芦醚绝大部分位于该预测疏水性内腔中,且与Lys74产生2个氢键。【结论】中华蜜蜂AcerASP2由于特殊的空间结构而具有较强的气味信息结合能力,且易通过与疏水内腔中的赖氨酸残基产生氢键而促进结合。     

全基因组重测序解析重庆武隆中华蜜蜂遗传变异及种群分化特征

【目的】解析重庆武隆中华蜜蜂的遗传变异及种群分化特征,为该地区传粉昆虫的遗传多样性研究提供理论参考。【方法】对重庆武隆中华蜜蜂进行全基因组重测序,并结合我国其他地区57群中华蜜蜂的重测序原始数据进行种群遗传分化分析。【结果】测序共获得武隆中华蜜蜂有效数据(clean data) 33.53 Gb,发现高质量单核苷酸多态性(SNP)位点共3 886 321个,小片段的插入与缺失(small indel)位点1 392 028个。在武隆中华蜜蜂样品中筛选出具有相同变异位点的非同义SNP突变基因589个,编码区发生small indel的基因214个。这些基因主要富集于赖氨酸降解、轴突导向、细胞外基质受体互作和丝裂原活化蛋白激酶信号通路。最终获得16个具有相同SNP和small indel的突变基因,其中包括嗅觉受体基因2个、细胞色素P450基因1个。武隆中华蜜蜂与我国其他地理型中华蜜蜂可能存在显著的遗传分化,与华中中蜂和北方中蜂(陕西安康)种群的亲缘关系较近。【结论】推测氨基酸代谢、神经系统发育、嗅觉进化、抗逆性能改善以及对温度偏好性的转变与武隆中华蜜蜂适应重庆本地自然环境有关。随意引种可...     

百子莲胚性愈伤组织在超低温过程中的 蛋白质组学研究

【目的】从蛋白质组学层面揭示植物胚性细胞对超低温保存复合逆境的响应调控机制,筛选出百子莲胚性愈伤组织在超低温保存中的差异表达蛋白,进一步丰富观赏植物超低温保存的分子生物学理论。【方法】利用iTRAQ技术鉴定百子莲胚性愈伤组织在超低温保存四个关键步骤(预培养、玻璃化脱水处理、洗涤和恢复培养)中的差异表达蛋白,应用生物信息学分析方法构建细胞响应超低温保存复合逆境的蛋白调控网络,筛选出植物超低温逆境保护类蛋白。【结果】共鉴定到2730种蛋白,筛选出821个差异表达蛋白。GO功能注释分析结果表明差异表达蛋白主要参与代谢、细胞过程和刺激应答等生物学过程,而催化活性和分子结合是最主要的分子功能类别。KEGG通路分析结果表明差异表达蛋白主要富集于能量代谢、蛋白的合成与降解、信号转导及细胞质膜修复等通路。通过STRING软件构建差异表达蛋白互作调控网络,发现上调表达蛋白主要参与糖代谢、氧化还原过程和核糖体翻译过程,下调表达蛋白主要参与ROS代谢、DNA修复、抑制细胞程序性死亡过程和细胞骨架。此外,筛选到96个与逆境保护相关的差异表达蛋白,分别参与能量代谢、氧化还原平衡、蛋白质合成与降解和信号转导。【结论】在超低温保存过程中,百子莲胚性愈伤组织的能量代谢、氧化应激与蛋白降解及PCD有所加剧,而细胞的ROS清除和胁迫防御过程明显下降,即百子莲胚性愈伤组织在超低温复合逆境下形成以糖代谢和抗氧化系统为主的抗逆保护机制。     

中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA的克隆及原核表达

 【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a（+）/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2（GenBank登录号：DQ449667）的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429 bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7 kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Acer-ASP2极有可能属于GOBP家族。构建的原核表达载体pET/Acer-ASP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为21kD的融合蛋白,融合蛋白大部分以包涵体的形式存在于菌体沉淀中（约59.7%）,经洗涤和尿素梯度溶解对包涵体进行了纯化,经凝胶光密度扫描分析,约占最终产物的81.2％左右。【结论】克隆、分析和表达了一个新的编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA序列,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础。     

亚致死剂量吡虫啉对中华蜜蜂神经代谢基因表达的影响

【背景】新烟碱类杀虫剂的作用靶标是昆虫神经系统中的乙酰胆碱受体,由于其良好的内吸性及对人畜低毒性,使其在农业生产上获得了广泛应用,然而这也使得其在植物体内仍然具有较低的残留,而这种亚致死剂量残留仍可对访花昆虫如蜜蜂的行为和神经系统造成不利影响。【目的】明确亚致死剂量新烟碱类杀虫剂吡虫啉对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）神经生理和代谢系统的影响。【方法】首先以两个亚致死浓度梯度剂量5和10 μg·L^-1吡虫啉处理工蜂10 d（3个生物学重复）,提取总RNA后,以RNA-seq方法对所得文库进行高通量测序,利用生物信息学技术对序列进行从头组装、注释,并对亚致死剂量吡虫啉处理后的差异表达基因进行聚类和富集等分析,最后利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术对部分与中蜂神经和代谢系统相关的差异表达基因进行验证。【结果】从两个吡虫啉浓度梯度和对照组数据中共获得9个测序文库,测序有效数据比例超过94.45%,从获得的37 364个unigenes中鉴定出571个差异表达基因。经GO和KEGG富集分析发现这些差异表达基因主要与蛋白质翻译、氧化还原、氧化磷酸化和核糖体等多个通路有关,表明亚致死剂量的吡虫啉对中蜂多个生理过程和代谢通路造成影响。挑选了与昆虫神经信号传递和代谢功能有关的上调或下调差异表达基因,如神经肽F、神经肽SIFamide受体、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶、激酶（PRKA）锚蛋白1、碳酸酐酶、超氧化物歧化酶、NADH脱氢酶亚基、表皮蛋白和气味结合蛋白17共9个差异表达基因进行了qPCR验证,其表达规律与转录组结果完全一致。【结论】亚致死剂量的吡虫啉能对中蜂神经信号转导、细胞呼吸、免疫反应、内环境稳态的维持和嗅觉感受等多方面造成影响。     

感染意大利蜜蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫及其纯化孢子的高表达基因分析

为探究东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)在侵染意大利蜜蜂(Aips mellifera ligustica)过程的基因表达谱及高表基因(highly expressed gene,HEG)的功能,本研究利用RNA-seq技术对N.ceranae感染的意蜂工蜂7和10 d工蜂中肠(NcT1和NcT2)及其纯化孢子(NcCK)进行高通量测序。根据FPKM值≧15的标准筛选出各组的HEG并进行Venn分析,进而通过GO分类和KEGG代谢通路富集分析对各组的共有HEG进行功能注释。测序得到的原始读段经严格质控后分别得到5 816 465、28 501 225和210 824 312条高质量的有效读段,分别从NcT1、NcT2和NcCK中筛选出1 263、1 233和1 511个HEG,其中有1 079个基因在各组均高量表达,分别有15和7个基因仅在NcT1和NcT2中高量表达。GO分类结果显示,共有HEG涉及9个生物学进程相关条目,10个细胞组分相关条目,以及5个分子功能相关条目。KEGG代谢通路富集分析结果表明,共有HEG富集在218条代谢通路,富集基因数最多的是核糖体、Epstein-Barr病毒感染、细胞周期、内质网蛋白加工和真菌核糖体生物合成。深入分析结果显示分别有5和5个共有HEG富集在MAPK和cAMP信号通路,表明此2条信号通路及富集的HEG可能在N.ceranae的环境应激和侵染过程中发挥重要作用。研究结果提供了N.ceranae感染意蜂工蜂过程中的基因表达谱,揭示了HEG的作用,为深入解析N.ceranae的侵染机制打下了初步基础。