中国新疆小反刍兽疫病毒F基因序列分析

为分析中国新疆小反刍兽疫病毒(PPRV)毒株分子演变特点和疫情传播路线,从GenBank数据库下载所有国家全部的PPRVF基因全序列,应用DNAStar软件,结合疫情毒株时空分布进行序列分析。结果显示,中国新疆PPRV株F基因全序列,与2014年小反刍兽疫情中河南和北京毒株核苷酸的同源性最高,为99.8%~99.9%,与中国西藏3个毒株核苷酸的同源性为97.7%,与中国采用的疫苗株核苷酸同源性为92.9%,核苷酸同源性最低的是肯尼亚毒株,与国外毒株核苷酸同源性最高的是印度毒株。F基因系统进化关系分析显示,中国新疆PPRV株属于基因Ⅳ系。F蛋白氨基酸同源性结果显示,除与科特迪瓦1989年毒株ICV89氨基酸同源性最低外,与其他氨基酸同源性比对结果均与核苷酸的比对结果一致。中国新疆PPRV株存在一定程度的变异,可能是由周边国家传入。     

我国小反刍兽疫病毒H基因序列分析

为了分析我国小反刍兽疫疫情的特点,从GenBank下载我国和其他国家小反刍兽疫病毒(PPRV)毒株H基因全序列,应用分子生物学软件DNAStar进行序列分析。结果显示,始于2007年的我国首次PPR疫情中,我国西藏地区PPRV各毒株间H基因核苷酸同源性介于99.6%~100.0%之间,我国西藏与其他国家PPRV毒株核苷酸同源性介于86.7%~98.3%之间;我国西藏地区PPRV毒株间氨基酸序列同源性介于99.7%~100.0%之间,我国西藏与其他国家PPRV毒株氨基酸序列同源性介于89.3%~98.4%之间。始于2013年年底的我国又一次PPR疫情中,我国PPRV毒株间核苷酸同源性介于99.7%~99.8%之间,我国与其他国家PPRV毒株核苷酸同源性介于87.2%~97.5%之间;我国PPRV毒株间氨基酸序列同源性介于99.2%~99.8%之间,我国与其他国家PPRV毒株氨基酸序列同源性介于89.0%~98.4%之间。H基因进化树分析结果显示,我国的9株PPRV划分为基因Ⅳ系。我国PPRV毒株与印度毒株及土耳其毒株同源性最高,可能由这2个国家传入我国。     

中国小反刍兽疫疫情分析

为分析中国PPRV毒株分子演变特点和疫情传播路线,从NCBI下载中国和世界其他国家全部PPRV毒株N和F基因全序列,应用分子生物学软件,并结合疫情发生的地理位置进行系统分析。结果显示,中国西藏阿里地区PPRV毒株之间核苷酸同源性为100%,其与西藏那曲地区毒株核苷酸同源性为99.9%;中国毒株与其他国家毒株F基因核苷酸序列分析显示,同源性为89.7%~98.8%,同源性最低的为科特迪瓦1989年毒株,同源性最高的为孟加拉国2010年毒株;N基因核苷酸序列分析显示,同源性为69.5%~98.5%,同源性最低的为朝鲜2002年毒株,同源性最高的为印度1995年毒株;F和N基因系统进化关系分析均显示,中国西藏3株PPRV均属于基因Ⅳ系;截止2014年3月30日,中国由西至东9省份发生该疫情。更加全面的分析结果,有待于更多PPRV流行毒株N或F基因全序列在GenBank的公布。     

中国小反刍兽疫病毒M基因序列分析

为了分析中国PPR的流行特征,从Genbank数据库中下载PPRV M基因核苷酸全序列及其对应的氨基酸序列,应用DNAStar分子生物学软件对其进行遗传演化分析。结果显示,中国2013~2014年PPRV毒株间M基因核苷酸同源性范围为99.8%~100%,与西藏3个PPRV毒株M基因核苷酸同源性范围为97.9%~98.1%,与国外PPRV毒株M基因核苷酸同源性范围为89.5%~98.2%,即核苷酸同源性最高的为印度Sungri 1996 MSD株。中国2013~2014年PPRV毒株间M蛋白氨基酸同源性为100%,与西藏3个PPRV毒株M蛋白氨基酸同源性均为97%,与国外PPRV毒株M蛋白氨基酸同源性范围为96.7%~100%。M基因核苷酸进化树分析显示,中国2013~2014年PPRV毒株与西藏的3个毒株不在同一分支,与印度毒株关系较近。推断中国2013~2014年PPR疫情非西藏2007年疫情的延续,可能为印度等周边国家传入。     

PPRV中国新疆南疆株F基因遗传演化分析

【目的】分析中国新疆南疆2014年PPRV毒株来源,为中国新疆南疆PPR防控提供理论依据。【方法】调查中国新疆南疆阿克苏地区某羊场发病羊发病情况、临床症状观察及病理学检查,实验室进行PPRV F基因RT-PCR和F基因测序,进一步对PPRV F基因序列分析。【结果】毒株与国内PPRV毒株F基因核苷酸同源性最高的是中国新疆China/XJYL/2013毒株,与国外的毒株F基因核苷酸同源性最高的是印度Izatnagar/94毒株及Izatnagar-94毒株;此次毒株与国内PPRV毒株F蛋白氨基酸同源性最高的是中国新疆China/XJYL/2013毒株,与国外的PPRV毒株F蛋白氨基酸同源性最高的是印度Izatnagar/94毒株。PPRV毒株F基因进化树分析显示:PPRV毒株与北京PPRV毒株进化关系最近,与中国新疆伊犁PPRV毒株同属一个分支,与国外印度及孟加拉国毒株的进化关系较近。【结论】2014年中国新疆南疆存在PPR疫情,该疫情毒株与此次疫情前后国内的PPR毒株及印度PPR毒株进化关系较近。     

小反刍兽疫的流行病学及疫苗研究现状

小反刍兽疫病毒(PPRV)是小型反刍动物的重要病原体,在非洲、近东、中东及亚洲大部分地区流行.尽管已有针对小反刍兽疫病毒有效且廉价的减毒活疫苗,但该病毒仍在继续传播.PPRV是一种麻疹病毒,鉴于根除同样为麻疹病毒属牛瘟病毒方面的经验,根除PPRV可行,但有许多关键领域缺乏关于PPRV的基础和应用病毒学研究.本文对小反刍...     

广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因 克隆与序列分析

[目的]了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)毒株gp64基因的保守性,并掌握其具体的突变位点,为研究核型多角体病毒(NPV)种内的微进化模式提供参考依据.[方法]对广西不同桑蚕产区的19株BmNPV毒株进行gp64基因克隆与测序,分析完整开放阅读框(ORF)序列的同源性和单核苷酸多态性,并构建基于gp64基因的遗传进化树.[结果]广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列不一致,存在1590、1593和1599 nt三种类型,是由于第94~96位缺失GCG或第97~102位插入GCGCCG所致,且插入核苷酸突变仅在广西BmNPV毒株中出现.仅GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%,其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在98.7%~99.6%.19株广西BmNPV毒株被分为两个亚群(cladeⅠ和cladeⅡ),其中11株独立形成cladeⅡ,7株独立形成cladeⅠ中的一个亚群;广西毒株在多个位点出现同义核苷酸突变,呈一定的规律性.[结论]广西BmNPV毒株的gp64基因具有遗传多样性,在遗传进化上较独立,插入突变显示出地域特点.     

广东省牛流行热病毒分离株JM 2020的全基因组测序及进化分析

【目的】分析广东省牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)分离株JM 2020与其他地区毒株的进化关系,阐明遗传进化与全基因组的特征,为中国乃至世界对牛流行热疾病的流行情况以及预防该疾病提供有用信息。【方法】根据从GenBank下载的BEFV毒株的全基因组序列信息,设计引物PCR扩增糖蛋白(Glycoprotein,G)基因;另设计10对引物用于扩增全基因组,送测序得到10个片段的基因序列,运用DNAStar软件中的EditSeq手动编辑和拼接获得全基因组序列。运用MEGA 6.0分别构建G基因和全基因组进化树进行进化分析。【结果】JM 2020毒株的G基因和全基因组与泰国毒株的核苷酸序列相似性均最高,分别为94.9%～99.3%和99.0%,进化分析表明JM 2020与2013—2017年泰国毒株处于同一小分支,而与JB76H、JT02L等国内毒株有一定进化距离。全基因组测序结果表明,JM 2020全基因组长度为14 902个核苷酸(nt),包括50 nt的前导序列,1 296 nt的核蛋白(Nucleoprotein,N)基因,837 nt...     

山羊α-干扰素基因克隆、原核表达及其抗病毒活性研究

为研究雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异及重组α-干扰素的抗病毒活性，采用RT-PCR扩增雷州山羊α-干扰素基因，分析其核苷酸序列；采用PCR方法扩增山羊α-干扰素基因成熟肽编码序列，构建原核表达载体pET- mIFN-α，并在大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达；采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白rG-mIFN-α；通过细胞病变抑制法测定其抗小反刍兽疫病毒（PPRV）和山羊痘病毒（GPV）活性。结果表明，雷州山羊α-干扰素全基因由570个核苷酸组成，编码189个氨基酸；与GenBank 上发表的山羊、林麝、弯角大羚羊、黄牛、瘤牛、绵羊、猪、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为99.8%、95.6%、96.8%、94.7%、94.7%、96.8%、81.6%、77.8%和70.0%；氨基酸序列同源性分别为100%、92.6%、94.7%、92.1%、93.2%、93.7%、67.9% 、61.6%和55.3%，提示反刍动物α-干扰素基因的核苷酸和氨基酸序列高度保守；rG-IFNα主要以包涵体形式存在，分子质量约32 ku；重组山羊α-干扰素能显著抑制PPRV和GPV感染引起的细胞病变，其抗PPRV和GPV效价分别为1.6×10⁴ U/mg和1.35×10⁴ U/mg。     

中国几省市猪萨佩罗病毒巢式RT-PCR检测与遗传进化分析

为了准确了解猪萨佩罗病毒(Porcine Sapelovirus,PSV)在中国流行情况及遗传进化规律,试验针对PSV 5'-NTR基因利用巢式RT-PCR方法对2015～2017年来自中国部分省市规模化猪场采集的368份样品进行检测,将阳性样品对VP1基因进行克隆、测序、构建进化树。巢式RT～PCR检测结果表明,368份样品中24份样品为阳性,总阳性率为6.52%;8份样品测序成功,序列分析结果表明核苷酸同源性为77.0%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性为83.6%～100.0%,遗传进化分析结果显示,中国地区的PSV病毒呈现出遗传多样性,其中3个毒株与德国参考毒株亲缘关系较近,2个毒株与国内外参考毒株的亲缘关系均较远,变异较大。研究丰富了PSV分子流行病学资料,为进一步研究该病毒提供了参考。     

小反刍兽疫N5蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种适用于PPRVN蛋白抗体的间接ELISA检测方法,应用于PPR防疫.【方法】根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,设计1对特异引物对N5基因扩增,经测序分析后将N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,成功构建pET-32a-N5质粒.将pET-32a-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达获得重组蛋白,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,重组蛋白分析具有良好的反应原性.【结果】利用原核表达纯化的PPRV N重组蛋白作为包被抗原,初步建立了一种能够检测针对PPRV N蛋白抗体的间接ELISA方法.用建立的方法对112山羊份血清进行了抗体检测,该方法与竞争ELISA试剂盒对比,临床符合率94.8%.【结论】该方法具有较好的敏感性、重复性和特异性.     

小反刍兽疫病毒细胞膜受体的鉴定

【目的】对小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus,PPRV）H蛋白胞外区（tH）细胞膜受体进行鉴定,为PPRV致病机制的研究奠定基础。【方法】克隆PPRV H基因胞外区（tH）,在毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行真核表达,纯化后免疫家兔,获得兔抗PPRVtH蛋白特异性抗体;提取山羊外周血淋巴细胞膜蛋白,经SDS-PAGE检测后,湿转印法转印至NC膜,分别利用纯化的重组tH蛋白和PPRV进行病毒铺覆蛋白结合试验（VOPBA）,对受体进行鉴定。【结果】成功克隆了1 653 bp的PPRV tH基因,构建其重组酵母表达质粒pPIC9K-tH,诱导表达后获得了60 ku目的蛋白。重组tH蛋白免疫家兔后获得了效价为1∶200的抗血清。Westernblotting分析发现,该重组蛋白可与PPRV多克隆抗体发生特异性反应,山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上有2个与PPRV和重组tH蛋白结合的蛋白带,分子质量约为38和100 ku。【结论】从山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上鉴定到了2种与PPRV结合的蛋白组分,其特性有待于进一步研究。     

苜蓿植株再生及PPRV-F基因转化条件的研究

以苜蓿品种甘农1号下胚轴为外植体,研究不同培养基对苜蓿愈伤组织、体细胞胚形成的影响,通过体细胞胚发生途径建立再生体系,在此基础上,摸索农杆菌介导小反刍兽疫病毒F基因的转化条件。结果表明:所选培养基愈伤组织诱导率均为100%,UM+0.1mg/L NAA+0.5mg/L KT为诱导体细胞胚的最佳培养基。农杆菌介导的苜蓿遗传转化条件为:下胚轴预培养3d,农杆菌菌液侵染15min,然后在培养基上铺一层灭菌滤纸共培养3d后清洗,选择压为卡那霉素(Km)75mg/L,抑菌浓度为头孢霉素(Cef)300mg/L。本研究为制备防治小反刍兽疫转基因植物疫苗奠定了基础。     

林麝饲养种群mtDNA遗传多样性和遗传结构分析

[目的]研究林麝饲养种群的遗传多样性现状及遗传结构,为指导种群遗传管理及其饲养种群种质保护与利用提供理论依据.[方法]遴选陕西省宝鸡市凤县的片仔癀麝场和逢春麝场,汉中市留坝县的太子岭麝场,采用分子粪便学的方法,采集220份新鲜的粪便样品,成功获得112条mtDNA控制区序列,计算单倍型多样性和核苷酸多样性.[结果]在3...     

基于全长转录组序列、核基因与叶绿体基因分析琼岛杨在杨属的亲缘关系

  目的  琼岛杨是我国热带地区发现的一种杨树，至今其分类和进化鲜有报道。本研究旨在通过三代全长转录组测序等方法了解琼岛杨在杨属中的分类与进化。  方法  基于Pacbio Sequel测序技术获取的热胁迫下琼岛杨、加杨和小叶杨完整全长转录本数据，通过直系同源基因计算非同义替换值（Ka）、同义替换值（Ks）及Ka/Ks值，比较直系同源基因在热胁迫下的表达模式，并结合毛果杨和簸箕柳的直系同源基因，构建了5个树种的进化树来分析杨树亲缘关系。通过克隆琼岛杨核基因（nrDNA:UDP-SQ和POPTRDRAFT_575699）和叶绿体基因（cpDNA:atpⅠ和trnF），分析基因序列在琼岛杨种群中的多态性，计算琼岛杨种内遗传距离，及与19个树种（5个杨树组和1个类外群组）的种间遗传距离。基于最大似然法和最小进化法构建了琼岛杨与19个树种的进化树，以分析琼岛杨在杨属的亲缘关系。  结果  三代转录组测序共获得660组琼岛杨、小叶杨和加杨的直系同源基因，Ks平均值为0.150 5，峰值为0.02，Ka/Ks < 1，占比97.27%，这显示了3种杨树较近的亲缘关系。直系同源基因表达模式分析发现，3种杨树在热胁迫下具有相同的表达模式。利用遗传距离法计算琼岛杨与19个树种中atpⅠ、trnF、UDP-SQ和POPTRDRAFT_575699等4种基因遗传距离的平均值，发现琼岛杨与白杨组具有最近亲缘关系，平均值为0.011。  结论  基于三代全长转录组测序获得的直系同源基因分析显示出，琼岛杨与其他杨树具有较近亲缘关系。克隆cpDNA和nrDNA基因，计算遗传距离和构建的进化树均表明琼岛杨与白杨组具有最近亲缘关系。cpDNA的多态性以及进化分支置信度明显高于nrDNA，表明在琼岛杨中cpDNA比nrDNA基因更具备物种鉴别能力。      

基于SLAF-seq技术的白皮松SNP分子标记开发

  目的  在白皮松全基因组范围内开发大量特异性SNP分子标记,为白皮松关键基因定位、分子标记辅助选择和种质资源评价提供足够多的分子标记资源。  方法  本研究以5个群体的共52份白皮松资源为材料,选择火炬松基因组为参考基因组,利用特异性位点扩增片段测序技术（SLAF-seq）,在多态性SLAF标签上开发大量特异性SNP位点,并过滤出一批高质量SNP位点用于白皮松不同群体的遗传多样性分析。  结果  通过序列对比分析,共获得23 597 049个SLAF标签,其中具多态性的SLAF标签有370 659个,共开发得到1 291 290个白皮松群体SNP。在缺失率小于20%、次要等位基因频率（MAF）大于5%的条件下,对所有SNP位点进行过滤,共得到346 840个高一致性的白皮松群体SNP,占SNP总量的26.9%,其中包含9个仅在北京鹫峰（JF）群体中存在变异的SNP位点、148个仅在陕西蓝田（LT）群体中存在变异的SNP位点、425个仅在甘肃麦积山（MJS）群体中存在变异的SNP位点、1 466个仅在陕西午子山（WZS）群体中存在变异的SNP位点、4个仅在山西柏洼山（BWS）群体中存在变异的SNP位点。基于过滤后的346 840个SNP分子标记在5个白皮松群体中进行的遗传多样性分析表明,白皮松不同群体间的遗传多样性存在显著差异,其中MJS和WZS群体的遗传多样性水平相对较高,JF群体的遗传多样性水平相对较低。  结论  研究结果表明,利用SLAF-seq技术可以实现全基因组范围内大量SNP标记位点的开发,且开发的SNP标记在白皮松不同群体中表现出较为丰富的遗传多态性,为白皮松种质资源鉴定、QTL定位、遗传连锁图谱构建以及重要性状的关联分析等研究奠定了基础,对今后白皮松种质资源保护和分子标记辅助选择育种具有重要意义。      

油松林土壤有机碳储量变化及其影响因素

  目的  通过探究油松林Pinus tabulaeformis土壤有机碳质量分数和储量的垂直变化和时间变化特征，为油松林土壤碳储量预测和碳汇管理提供理论依据。  方法  基于1980?2017年文献数据，综合运用单因素方差分析、多重比较、相关性分析和通径分析等方法，探讨棕壤和褐土2种土壤类型下油松林土壤有机碳质量分数及储量变化特征，并结合不同时期中国森林经营措施和油松生长特征分析其驱动因素。  结果  油松林土壤有机碳质量分数和储量变化随土层深度增加而显著降低(P＜0.05)，0~20 cm土层是碳库的主要贡献层，占0~60 cm土层土壤有机碳储量的45%~50%；近40 a间土壤有机碳质量分数和储量呈先减少后增加的时间变化特征，其中，2000?2009年为最低点，而后出现较大幅度增加，在2017年达到储量最高点，为247.02 Tg。  结论  土壤容重、土壤全氮和林分郁闭度是油松林土壤有机碳质量分数(储量)变化的主要因素，不同时期森林经营和保护措施对三者的深刻影响是油松林土壤有机碳质量分数和储量呈现明显时间变化的重要原因。图3表5参49     

2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV S基因型分析

2010年以来,全国大部分地区暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在浙江省的流行和遗传变异情况,对2010—2013年收集的临床腹泻样品,以针对PEDV S基因N端序列的RT PCR检测病原,并测序其中的41份样品的扩增序列,分析PEDV S1基因型变异情况。临床检测结果表明：　PEDV临床检出率由2010年的4286%提高到2013年的70%以上,并且浙江省各地的检出率都在50%以上;一年中7至8月份检出率明显降低。 PEDV S1基因N端序列分析结果表明,临床检测株的S1基因与传统毒株PEDV CV777的S基因序列及中国最早检测到的基因序列亲缘关系较远,可能浙江省PEDV的流行株可能属于一个新的基因型。同时研究结果提示PEDV S基因的变异可能是现有CV777毒株疫苗免疫保护力不佳的原因。     

3种竹子内生固氮菌特征及多样性

  目的  了解不同竹子内生固氮菌及其定殖土壤根区固氮菌的特征和生物多样性。  方法  以毛竹Phylloslachys edulis、狭叶青苦竹Pleioblastus chino、孝顺竹Bambusa multiplex叶部、根部及定植土壤为对象，设计nifH固氮基因引物，采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和随机克隆技术，通过聚类分析、Shannon多样性指数分析构建系统发育树。  结果  不同竹子根区土壤之间、同一竹种根部与叶部之间、不同竹种同一器官之间、根区土壤与植物之间的固氮菌群落结构差异明显，同一竹种叶部或根部的重复样品相似度均不高；根部内生固氮菌种类总体多于叶部，土壤固氮菌与根部内生固氮菌相似度高于叶部。不同竹种不同器官间固氮菌Shannon多样性指数差异显著，孝顺竹叶部(2.73)与土壤(2.70)大于根部(2.53)(P＜0.05)，狭叶青苦竹根部和毛竹根部大于叶部和土壤(P＜0.05)。植物样品随机克隆测序对比得到83株固氮菌，仅12株为可培养固氮菌株，分别属于慢生根瘤菌属Bradyrhizobium、Dechlorosoma、固氮螺菌属Azospirillum、肠杆菌属Enterobacter、Kosakonia、变形杆菌属Gammaproteobacteria、红长菌属Rubrivivax和Azohydromonas。系统发育树结果表明:3种竹子内生固氮菌明显不同于其他植物。  结论  土壤环境、竹子种类及组织器官均能影响竹子内生固氮菌的结构特征和多样性，定殖于根部的内生固氮菌多样性显著高于叶部。3种竹子内生固氮菌种类与已报道的禾本科Gramineae植物差异显著。图4表4参30     

锈色粒肩天牛幼虫的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段序列分析

  目的  基于分子生物学手段,探讨可快速准确鉴别锈色粒肩天牛Apriona swainsoni幼虫与其他天牛幼虫的目标基因,为该保健昆虫的食药用安全提供保障。  方法  利用线粒体COⅠ、COⅡ、Cytb基因和28S细胞核基因的通用引物分别克隆获得4种基因片段,并进行同源序列检索、多重比对、序列信息分析及进化树构建。  结果  基因克隆最终获得锈色粒肩天牛4种基因序列的片段大小分别为817、545、434和1 088 bp。特殊位点分布结果显示:28S的保守位点占比最高,其后依次为Cytb、COⅠ和COⅡ,变异率则正好相反。COⅠ、COⅡ和Cytb基因片段的碱基组成和替换信息特点均表现为A+T含量>G+C含量,颠换高于转换,28S基因片段则表现为A+T含量  结论  COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因均可作为鉴定该虫的分子生物学参考依据。