H5亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备和鉴定

采用高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1亚型A/Duck/Zhenjiang/11/00(DZJ/1100)毒株作为免疫原,免疫8周龄BALB/C雌性小鼠,三次加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,用表达的重组核蛋白(NP)包被ELISA的方法检测筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得H5亚型特异性的单克隆抗体,抗体亚类检测结果表明该抗体亚类为IgG1型k链抗体。ELISA以及免疫荧光检测表明该抗体有良好的特异性。     

肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查

为了解养殖场家禽中H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平,通过血清学调查,应用血凝抑制试验(HI)的方法,对四川内江、山东济南、河南鹤壁、江苏扬州4个定点实验观测站负责的养殖场的鸡血液样本进行禽流感病毒抗体分析,其中包含2个肉鸡场和3个蛋鸡场。研究发现蛋鸡场通常免疫了H5、H7、H9(或H5与H9)亚型禽流感疫苗,而肉鸡场只免疫了H9亚型禽流感疫苗;蛋鸡场和肉鸡场都存在免疫禽流感疫苗后抗体水平低和无抗体产生的情况,从而导致免疫不合格或免疫失败。以上结果表明,应加强家禽养殖场对不同亚型禽流感疫苗的免疫以及免疫后的禽流感病毒抗体水平监测,以防免疫失败,从而预防禽流感的发生和流行。     

重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗对商品蛋鸡免疫程序优化

为优化商品蛋鸡场禽流感的免疫程序,掌握商品蛋鸡场H5亚型禽流感母源抗体的消长规律和不同首免日龄免疫禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)疫苗的抗体效价消长情况,本试验将商品蛋鸡分成5组,1～4组为试验组,分别于7、10、14和21日龄免疫禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗,第5组为空白对照组,...     

禽流感病毒H5和H9亚型RT-PCR检测方法的建立

根据H5和H9亚型的HA基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了RT-PCR检测方法,优化了反应体系及反应条件,该方法敏感性可达10^-3,特异性好,与NFV、IBV与H5与H9相互间无交叉反应。利用所建立的RT-PCR检测了10份活禽及禽产品中存在的H5和H9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30％,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,证明该方法具有很好的应用价值。     

H5亚型禽流感灭活疫苗的研制

以H5N1亚型禽流感病毒接种鸡胚，收取鸡胚液为抗原研制了禽流感灭活疫苗，并对制苗抗原以及疫苗的物理性状、安全性、免疫效力、免疫剂量和保护期等进行了试验。结果表明，获得了较高效价的制苗抗原．灭活前后HA分别为2^10.0-11.0和2^9.0-10.0。试制疫苗物理性状符合要求，安全性良好。试验鸡在免疫14d后血清抗体达到2^7.5，210d血清HI抗体仍维持在2^5.0左右；免疫后18d使用高致病性H5亚型禽流感病毒攻毒，获得100％的保护。分别使用0．1，0．3和0．5mL免疫鸡，发现0．3～0．5mL剂量组免疫后血清抗体达到2^7.4-8.0。疫苗在2～8℃保存540d，疫苗物理性状没有改变，免疫后血清HI抗体可以达到2^7.5。这提示研制的疫苗可以有效控制禽流感H5亚型的流行。     

H5N1亚型禽流感病毒对鸡的致病性研究进展

对鸡感染H5N1亚型禽流感病毒（AIV）后的临床表现、大体病变、病理组织学、生理生化指标、细胞免疫功能、病毒的组织分布和细胞凋亡的研究进展进行概述,探讨了该病毒对鸡高致病性的分子基础．     

H5亚型禽流感病毒分离株对金刚烷胺耐药性的鉴定

对1株H5亚型禽流感病毒（AIV）分离株进行了金刚烷胺耐药性的鉴定．应用RT—PCR获得了AIV178株的M基因,序列分析显示M2蛋白有S31N的点突变;动物试验发现该毒株对200mg／L金刚烷胺饮水途径给药仍有抗性．结果表明AIV178分离株具有对金刚烷胺的耐药性,而且M2蛋白的第31位氨基酸突变可能与此有关．     

H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的H5亚型禽流感病毒(AIV)抗原免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选,获得9株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中4株能高效分泌血凝素(HA)蛋白特异性的单克隆抗体.特异性试验表明,IE6单克隆抗体仅与试验的H5病毒株反应,而不与新城疫病毒(NDV)、H9亚型AIV和产蛋下降综合症病毒(EDSV)反应.这9株单克隆抗体分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM亚类,κ轻链.     

H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H5、H7、H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)编码基因,使用DNAStar软件比较分析筛选出特异的保守片段,设计3对引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基础上,建立了H5、H7、H9亚型禽流感的三重RT-PCR检测方法,本方法可同时检测出样品中的H5、H7、H9亚型禽流感病毒。敏感性试验结果表明,该方法检测H5、H7、H9亚型禽流感RNA的敏感性分别达2.80、10.50、5.73 pg/μL,该方法检测其他相关病毒时均为阴性,具有很高的特异性,此外,该方法具有良好的重复性。利用所建立方法对240份禽流感临床样品进行检测,结果与血凝试验和血凝抑制试验结果的符合率为100%。此诊断方法检出时间早,且特异、敏感、经济、快速,可普遍推广,在禽流感诊断和防制中具有重要意义和应用价值。     

胸腺肽α1对H5亚型禽流感疫苗的免疫增强作用

为了研究Tα1的免疫增强效果,以120只1日龄SPF鸡作为试验对象,联合应用表达Tα1的重组质粒pcDNA-Tα1和H5亚型禽流感灭活疫苗,观察不同剂量Tα1对免疫鸡只血清HI抗体水平、免疫器官指数以及抗病毒作用的影响。结果表明:Tα1各剂量处理组在鸡只免疫后7～21 d对HI抗体水平有轻微抑制,28 d与正常免疫组达同一水平;鸡只的法氏囊、胸腺和脾脏免疫器官指数均显著增加(P<0.05),尤以低剂量组(50μg/只)效果最佳;攻毒后,Tα1各剂量组对鸡只的保护率均为100%。可见,Tα1对禽流感H5N1疫苗有较强的免疫促进作用,且呈现一定的剂量关系,以低剂量(50μg/只)的免疫增强效果最为理想。     

H5型高致病性禽流感免疫抗体监测及免疫效果分析

[目的]为了评估目前临床上大量免疫高致病性禽流感疫苗的免疫效果和质量。[方法]利用翅静脉法在127个养鸡场2、2个养鸭场、2个养鹅场1、个养鸽场采集血样,通过血凝抑制试验对H5型高致病性禽流感抗体进行监测,并分析免疫效果。[结果]5个养鸡场免疫不合格,8个养鸭场免疫不合格(主要为肉鸭场),2个养鹅场和1个养鸽场均免疫合格。抗体合格率为88.05%,免疫合格场达91.40%[。结论]雏鸡的最佳首免时间应为2周左右。经2次免疫接种的禽类保护力很高,免疫有效期可达4~6个月。     

蛋鸡群发生马立克氏病继发H9亚型禽流感的诊治

马立克氏病是一种重要的免疫抑制病,严重影响养鸡业的健康发展。通过对一例发生马立克氏病继发H9亚型禽流感的蛋鸡群的症状进行分析、剖检变化及实验室诊断,提出了治疗和预防措施,为马立克氏病和H9亚型禽流感的防治提供参考。     

免疫程序对肉鸡新城疫·禽流感(H5亚型)HI抗体消长规律的影响

[目的]为制定商品肉鸡新城疫(ND)、禽流感(AI)的免疫程序提供理论依据。[方法]在调查不同规模化养殖场免疫程序的基础上,制定商品肉鸡的免疫程序,分析不同免疫程序下ND和AI(H5亚型)HI抗体消长规律。[结果]1~7日龄商品肉鸡ND和AI的母源抗体均维持在免疫保护临界值之上。用ND疫苗免疫后,鸡群抗体水平不断下降,各免疫组均在24日龄最低。使用ND活疫苗和灭活苗的免疫组中ND抗体滴度比其他免疫组高。非免疫组AI(H5亚型)抗体滴度均随日龄的增加而逐渐下降,而免疫组24日龄后缓慢上升,38日龄达到免疫保护临界值。[结论]禽流感(H5亚型)灭活苗对商品肉鸡的免疫效果较差,应从免疫佐剂、抗原浓缩等方面进行新型商品肉鸡禽流感疫苗研究。     

青脚麻鸡新城疫和禽流感母源抗体的衰减规律研究

[目的]为青脚麻鸡的新城疫(ND)和禽流感(AI)预防提供依据。[方法]采用血凝抑制(HI)试验测定了3个鸡场青脚麻鸡在1～30日龄的AI H5、AI H9和ND母源抗体水平,并计算相应母源抗体的半衰期。[结果]3个鸡场的AI H5母源抗体水平均较低,1日龄母源抗体HI效价分别是5.8log2、7.2log2和6.0log2,AI H9和ND的母源抗体水平相对较高。青脚麻雏鸡的AI H5、AI H9和ND母源抗体平均半衰期分别为2.49、2.87和2.22 d。[结论]青脚麻雏鸡的AI H5首免日龄推荐为3～6日龄,AI H9和ND首免日龄推荐为7～12日龄。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备及检验

[目的]制备鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感[ND-IB-AI（H9亚型）]三联灭活疫苗。[方法]以NDV La Sota株、IBVM41株、AIV（H9亚型）WD株为毒种,分别接种鸡胚,制备NDV、IBV及AIV（H9亚型）抗原液;采用病毒超滤系统浓缩病毒抗原液,并用甲醛溶液进行灭活;将浓缩灭活后的3种抗原液按一定比例混合（1∶1∶1）,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗;对制备的疫苗进行无菌检验和物理性状观察。[结果]共制备了3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗实验室制品,经无菌检验为阴性,外观为乳白色,剂型为油包水型（W/O型）,粘度6.36.8 s,离心和37℃放置21 d均不分层。[结论]所制备3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗均无细菌污染,其物理性状均能达标。     

不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)\[GS/GD/96\]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8 μg HA/0.3 mL（肌肉注射）、103PFU/100 μL（刺种）、106EID50/100 μL（滴鼻、点眼）、15 μg/200 μL（肌肉注射）等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒（HPAIV） GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护（不发病、不致死、不排毒）;在病毒攻击前,灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）所诱导的HI抗体平均水平分别为875log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。     

鸡白细胞介素-18对H9亚型禽流感灭活油乳苗的免疫增强作用

[目的]探索鸡白细胞介素-18（IL-18）在H9禽流感（AI）灭活油乳苗免疫中的免疫佐剂作用.[方法]从鸡脾淋巴细胞中克隆鸡IL-18基因,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达质粒pIL-18.将重组真核表达质粒pIL-18、H9亚型AI灭活油乳苗及其二者联合分别免疫14日龄SPF鸡,检测其细胞免疫和体液免疫水平,评价鸡IL-18在H9亚型禽流感灭活油乳苗中的免疫增强作用.[结果]成功克隆了鸡IL-18全基因,大小为597 bp.质粒pIL-18和H9亚型AI灭活油乳苗联合免疫的SPF鸡所产生的HI抗体效价在接种第4周后明显高于H9亚型AI灭活油乳苗免疫组;其T淋巴细胞的增殖反应也强于H9亚型AI灭活油乳苗免疫组.[结论]质粒pIL-18能提高H9亚型禽流感灭活油乳苗诱发的免疫应答,为研究防制禽流感的新型疫苗提供了新思路.